原代细胞培养-小鼠胚胎分离实验

原代细胞培养，是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，在体外培养，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经胰酶消化，分散成为单个游离的细胞，在人工条件下培养，使其不断地生长及繁殖。

1. 取材：取怀孕母鼠，颈椎脱臼法处死后，整个鼠体侵入盛有纯酒精的烧杯中浸泡1分钟。取出母鼠在不锈钢手术盘中用无菌手术剪打开腹腔，取出鼠胚，放入无菌培养皿内。注意取材可在无菌操作台外操作。

2. 用70%酒精擦拭装有鼠胚的培养皿外周后，将培养皿移至超净工作台上，用含双抗的Hanks液洗涤鼠胚数遍去除血污。用无菌手术器械去除头、尾和四肢及内脏，余下组织用剪刀剪碎后，再用含双抗的Hanks液洗涤数次。最后用含血清的细胞培养液清洗。

3. 把组织块剪成1 mm³左右大小于培养液中，用无菌胶头吸管吸取组织块，注意要吸在专用的细胞长吸管前端细长部位，如吸得过高，可使组织小块黏附于管壁而无法吹出。组织块应均匀贴附于细胞培养瓶的底部，注意组织块间要留有空间，不要太密。

4. 翻转培养瓶，使贴附组织块的细胞培养面朝上，在培养瓶底加入细胞培养液3——5ml，不要加的太多以免培养液漏出产生污染。旋好瓶盖后在培养瓶侧用油性笔写上培养时间。细胞培养放于CO2恒温培养箱中，温度为37℃，CO2浓度为5%，完全湿度条件下进行培养，以利组织块贴附。

5. 2-3小时后，可见组织小块略干燥，牢固贴在瓶壁时，再慢慢翻转培养瓶，使细胞培养液缓慢浸泡组织块，继续培养。操作过程中，动作一定要轻缓，以免贴附在瓶壁上的组织块脱落，影响贴壁培养。然后将培养瓶置于37℃培养箱培养2-3天。

1. 培养液和培养物的比例：一定浓度的培养物仅能支持一定数量的细胞生长，不能盲目增加每单位体积的细胞浓度。

2. pH：初培养pH应为7.4，培养过程中应不低于7.0。

3. 培养瓶内的空间：一般培养瓶内培养液与液面上的空间体积之比为1:10。