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实验方法原理 | 这部分是一名实习生或学生应当首先接触的内容。大部分是简单易懂并易于操作的,为了使实验比较有趣,操作方案和备选方案以相互参考的方式详细列出。每一个操作方案中材料部分的指定数量见操作说明,但可以按比例调节。表2.1中黑体部分的练习是必需的。 首先有必要参观介绍组织培养的设施,这可以使实习生.见到其他职员,明确他们的角色和职责,了解必要的准备水平;需要解释储存的原则;需要注意灭菌和未灭菌物品的摆放和包装,组织培养级和非组织培养级塑料制品,使用物品和备份的储存,放在室温和放在4℃或一20℃的液体的区别;实习生需要知道物品的替换,不同物品的保存期限,备份物品如果快过期了要通知谁,调换物品顺序以便先使用早灭菌的物品。 |
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实验步骤 | |
实验方法原理 | 目的 快速准确地将液体从一个容器转移到另一个容器。 训练目标 熟练掌握吸管的使用,掌握必要的速度、准确性和精度。 监督:开始时连续监督,然后让实习生重复练习并记录准确度。 时间:30 min~ l h。 背景信息 已灭菌液体的操作(见 5.2.7 节);试剂瓶和培养瓶的操作(见 6.3.4 节);移液(见 6.3.5 节)。 示范材料或操作:教师需示范操作吸管,将吸管插人移液器,转移液体,并对速度和准确性间的平衡给出指导建议。教师也需要示范用真空泵抽出液体(如果实验室采用)并解释其机制和安全性规定。 标准方案 在垂直式层流洁净台中的无菌技术(见方案6.”或在敞开的工作台上进行操作(见方案6.2)。在着手整个方案前,让实习生练习简单的操作,如将水从试剂瓶中移到废液烧杯中。这可以使得练习者在进行无菌操作前便能熟悉操作。 |
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实验步骤 | 实验变化 l)这个练习的目的在于提高双手的灵巧性及无菌环境下对吸管和试剂瓶的操作。下面的附加步骤用于提高趣味性和检查实习生的完成情况。 2)先称量一’一下培养瓶并作为接受容器。 a)向5个培养瓶中各加入sm!液体。 b)使用sml吸管。 3)使用25ml吸管。 4)记录完成移液的时间。 5)再一次称量培养瓶。 6)孵育培养瓶看有没有污染。 数据 l)计算每个培养瓶中液体的平均重量。 2)记录其范围并且 a)计算分装液体体积所占的百分比,或 b)计算平均值或标准差: i)将数值填入Excel表格。 ii)将光标移动到数据列下面的一格。 iii)按下标准工具条中“艺”按钮,选择平均值。 iv)如果没有自动选择,则选择一列数值,按“Enter”键。这会给出数据的平均值。 v)将光标放置到下一格。 vi)按下标准一工具条中“艺”按钮,选择其他功能,然后选择STDEV。 vii)如果没有自动选择,则选择一列数据,并按“Enter”键。就得出了数据的相应标准差,据此你可以将它换算成平均值的百分比,由此可知移液操作的准确性。 |
注意事项 | 分析 l)比较每一个吸管的结果并评论其差别。 a)准确性。 b)时间。 2)如何正确选择吸管? 3)在移液的精度范围内可接受的误差是多少? 4)绝对的准确性或一致性哪个更重要? |
实验方法原理 | 目的 细胞培养的评判性检查。 应用 检查常规维持的一致性;在复苏、传代、冻存前培养状况的评估;对新的或实验性 情形反应的评估;确认明显的污染物。 训练目标 熟悉不同类型和不同密度的细胞培养的外观;数码或胶片相机的使用;灭菌物品和污染物间的区别,健康的和不健康的培养物间的 区别;培养物生长阶段的评估。 监督:在观察中保持连续性,摄影可以间断。 时间:30 min 背景信息 形态学,摄影(见16.4.5节)。 示范材料或操作:细胞形态,时相对比,固定和染色,免疫染色的照片样本;适于形态学研究的培养器皿的类型,如培养皿(图8.3)、盖玻片管、载玻片室(图16.3);悬浮培养物的离心涂片机(图16.4)。 安全提示:没有特殊的安全要求。 |
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实验步骤 | 观察一系列不同密度的细胞并摄影。 设备和材料 ”培养瓶或培养皿中一系列不同密度的细胞,最好是同一正常或转化细胞(例如,3T3和SV3T3,或BHK21一C13和BHKZI一PyY)的不同密度情况,包括中期(大约5()%汇合,有明显的有丝分裂)、汇合(100%的生长面积覆盖了细胞,但没有堆积)和汇合后期(细胞长成多层,如果是转化细胞就会堆积)。如果可能的话最好有低密度和高密度的悬浮细胞。 2)如果可能,最好有已污染的培养物样本(最好不要是培养皿,以避免扩散的风险)和不健康的培养物,例如,很长时间没有换液的细胞。 3)倒置显微镜,配有 4X, 10X , 20X 相差物镜和聚光器。 4)自动相机,最好是带监控器的数码相机,或带摄影目镜的胶片相机。 标准方案 l)打开显微镜电源,调节灯光强度(见方案16.1)。 2)从孵箱中取出培养物。最好在同一时间检查少量培养瓶,而不要将很多培养瓶长时间放在孵箱外。取出一对培养瓶,例如,低密度和高密度的同一细胞,或者同一细胞类型的正常和转化状态。 3)用肉眼观察每一个培养物,注意培养基的混浊度、pH是否下降或分裂中的细胞。 努力辨识单层细胞,寻找图像的特征。可以选择正常形态,例如,成纤维细胞汇合时的旋涡图案(图16.Zb,h和彩图sb)。 4)在倒置相差显微镜低倍镜下观察(4x物镜)细胞密度和细胞间相互作用的特征。 5)在中倍率(10X物镜)和高倍率(20X物镜)物镜下观察细胞的健康状态(图13.1),聚拢的特征,单层细胞的收缩或分开。 6)观察有无污染的特征(图19.la~c)。 7)寻找有丝分裂并粗略估计发生频率。 8)给每一种培养物照相(见方案16.6),注意培养物的细节(细胞类型,最后一次传代的时间)和细胞密度,以及任何你感兴趣的特殊特征., 9)将培养物放回解箱.取新的培养物垂复以上步孩。 补充方案:染色(见方案16.2,方案16.3);离心涂片(见方案16.4).间接免疫荧光(见方案16.11)。 实验变化 l)寻找相关培养物在生长模式、细胞密度和形态学方面的差异。 2)评估细胞的健康状态。 3)有无污染的迹象? 4)细胞是否准备好换液(见13.6.2节)或传代(见13.7.1节)? 5)通过计算20X物镜视野的面积和计数每个视野中的细胞数来从化地估计细胞密度.如果使用数码相机和监控器这就会变得很简单,可以川薄膜扭盖屏幕,用记号笔给每一个细胞做标记。 6)鉴别和计数这些高倍视野中处在有杖分裂,!,的细胞。 数据 定性 l)记录所有培养物在形态学、外形和生长形式方面的观察结果 2)注意任何污染物 3)确定健康状态及其他 定量 l)记录每一个培养物的细胞密度(细胞数 / cm2)。 2)记录每一个培养物的有丝分裂指数。 |
其他 | 分析 1)说明细胞密度的不同 2)说明有丝分裂指数的不同。 3)比较正常和软日七细胞以及高密度和低密度细胞外观,并试解释行为上的不同。 |
实验方法原理 | 目的 快速准确地将液体从一个容器转移到另一个容器。 训练目标 熟练掌握吸管的使用,掌握必要的速度、准确性和精度。 监督:开始时连续监督,然后让实习生重复练习并记录准确度。 时间:30 min~ l h。 背景信息 已灭菌液体的操作(见 5.2.7 节);试剂瓶和培养瓶的操作(见 6.3.4 节);移液(见 6.3.5 节)。 示范材料或操作:教师需示范操作吸管,将吸管插人移液器,转移液体,并对速度和准确性间的平衡给出指导建议。教师也需要示范用真空泵抽出液体(如果实验室采用)并解释其机制和安全性规定。 标准方案 在垂直式层流洁净台中的无菌技术(见方案6.”或在敞开的工作台上进行操作(见方案6.2)。在着手整个方案前,让实习生练习简单的操作,如将水从试剂瓶中移到废液烧杯中。这可以使得练习者在进行无菌操作前便能熟悉操作。 |
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实验步骤 | 实验变化 l)这个练习的目的在于提高双手的灵巧性及无菌环境下对吸管和试剂瓶的操作。下面的附加步骤用于提高趣味性和检查实习生的完成情况。 2)先称量一’一下培养瓶并作为接受容器。 a)向5个培养瓶中各加入sm!液体。 b)使用sml吸管。 3)使用25ml吸管。 4)记录完成移液的时间。 5)再一次称量培养瓶。 6)孵育培养瓶看有没有污染。 数据 l)计算每个培养瓶中液体的平均重量。 2)记录其范围并且 a)计算分装液体体积所占的百分比,或 b)计算平均值或标准差: i)将数值填入Excel表格。 ii)将光标移动到数据列下面的一格。 iii)按下标准工具条中“艺”按钮,选择平均值。 iv)如果没有自动选择,则选择一列数值,按“Enter”键。这会给出数据的平均值。 v)将光标放置到下一格。 vi)按下标准一工具条中“艺”按钮,选择其他功能,然后选择STDEV。 vii)如果没有自动选择,则选择一列数据,并按“Enter”键。就得出了数据的相应标准差,据此你可以将它换算成平均值的百分比,由此可知移液操作的准确性。 |
注意事项 | 分析 l)比较每一个吸管的结果并评论其差别。 a)准确性。 b)时间。 2)如何正确选择吸管? 3)在移液的精度范围内可接受的误差是多少? 4)绝对的准确性或一致性哪个更重要? |
实验方法原理 | 目的 操作已灭菌溶液时保持无菌状态。 训练目标 无菌操作:练习灵巧和无菌的操作。 监督:连续监督。 背景信息 无菌技术的目标(见 6.1 节);无菌环境的要素(见 6.2 节);无菌操作(见 6.3 节).在层流超净台中工作(见 6.4 节);可见的微生物污染物(见 19.3.1 节). 示范材料和操作:示范如何擦拭工作面和将物品拿人超净台。解释层流超净台和空气微粒过滤器的工作原理。给实习生示范如何打开和盖上培养瓶和试剂瓶的盖子,以及如何在工作面上摆放盖子。示范如何握持吸管,将其插人移液器,如何使它不碰到任何未灭菌的东西以免被污染,如何在无菌条件下转移液体,如何在移液时倾斜试剂瓶和培养瓶。强调清理和擦拭超净台并检夜卜作面下部. 练习 概要 向 I X 培养基储液中加人必需的添加剂和补充成分。 标准方案 用 I X 储存液制备培养基(见方案11.7)。 标准方案的实脸补充 1)向2个已灭菌试剂瓶中分别加人soml培养基. 2)将·个试剂瓶放置在4℃。 3)将另一个试剂瓶解育1周,观察有没有污染迹象(见19.3,1节)。 4)在练习4中使用这些瓶子。 |
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实验方法原理 | 目的 给单层细胞换新鲜培养纂。 应用 用于给快速生长的培养物在传代之间更换培养基,或从一种类型培养基换成另一种培养幕, 训练目标 加强无菌操作技巧.介绍细胞维持的一个基本原理,即在持续培养周期中更换培养基。让实习生观察培养基并明白耗竭培养基的特征.例如细胞密度和(或)pH降低,并观察有没有污染.r解交叉污染的风险。比较冷藏的培养基是否需预温。 监督:向实习生说明耗竭培养革的特征.并示范操作吸取和更换培养幕。 时间:30 min. 背景信息 更换培养篆(见13.6.2节);监控污染物(见19.4节);交叉污染(见19.5节). 示范材料和操作:练习需要至少三瓶半数汇合的连续培养细胞系,如Hela或Vero细胞,并且要标明接种时间和数址。给实习生示范如何从冰箱取培养基,井要强调每个细胞系需特定培养基,而不能混声U或操作。还要示范如何擦拭和整理超净台,牌箱的使用,将培养物放回解箱,用肉眼并在显微镜下观察细胞的状态(有无污染,是否需换液.艘康状态)。示范如何抽取培养基和更换新培养基,这需要真空泵或废液烧杯,如果有必要可以充5%c():。 安全提示:如果操作人谏细胞.需要使用U级生物安全柜,丢弃的培养基中要加人消毒剂(见7.8.5节和表7.7)。 |
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实验步骤 | 练习 概要 吸取并丢弃旧培养基,更换新鲜培养基。 标准方案 给单层细胞换液(见方案13.1)。 补充方案:完全培养基的制备(见方案11.7,11.8或11.9,以及练习3);pH标准色阶的制备(见方案9.1);培养皿或板的操作(见方案6.3)。 实验变化 在练习中更换了冷藏的和预温的培养基后.接下来需要做细胞计数(见练习12)另一瓶培养物则不换液,而是同时川胰蛋白醉消化。 背景:完全培养基(见方案9.5);换液(见13.6.2节)。 数据 比较已经更换了冷藏或预温的培养基(在练习12中计数)与未换液的培养物之间外观和生长的差异。 日常维护需在记录表中进行记录(表12.5),并且把实验数据填人练习12的表格。 |
实验方法原理 | 目的 清洗和灭苗污染的玻璃器皿。 训练目标 正确的准备工作和无菌区外的质呈控制。 监督:推荐有经验的清沽工带实习生熟悉标准程序。 时间:每次20~3omm较合适,所花的时间取决于实习生最后所参与岗位的程度和监督者的判断。 背景信息 洗刷区(见4.5.2节);清洗(见5.4.1节);玻璃器皿清洗机(见5.4.11节.图5.21);灭菌器(见5.4.4节;图5.18,5.19);清洗和灭菌设备(见11.3节)。 示范材料和操作:实习生要观察所有的步骤并尽可能的参与;这可能需要多次观摩来观寮完整的程序。实习生应当参观所有运作中的设备,包括摆放,质最控制(QC)和安全程序,不一定要操作设备,除非以后的职责将包括清洗和灭菌 |
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实验步骤 | 练习 概要 收集、漂洗、浸泡、清洗和灭菌玻璃器皿与吸管。 设备和材料 准备区的常规设备《见方案11.1~n.3)。 标准方案 l)玻瑞器皿的准备和灭菌(见方案11.1), 2)吸管的准备和灭菌(见方案11.幻。 3)螺口盖的准备和灭两(见方案11.3)。 补充方案:过滤装置的灭菌(见方案11.4) 数据 实习生要熟悉注意事项,记录质最控制数据,例如,烤箱和高压灭荫锅所显示的数字和图形。 |
实验方法原理 | 目的 清洗和灭苗污染的玻璃器皿。 训练目标 正确的准备工作和无菌区外的质呈控制。 监督:推荐有经验的清沽工带实习生熟悉标准程序。 时间:每次20~3omm较合适,所花的时间取决于实习生最后所参与岗位的程度和监督者的判断。 背景信息 洗刷区(见4.5.2节);清洗(见5.4.1节);玻璃器皿清洗机(见5.4.11节.图5.21);灭菌器(见5.4.4节;图5.18,5.19);清洗和灭菌设备(见11.3节)。 示范材料和操作:实习生要观察所有的步骤并尽可能的参与;这可能需要多次观摩来观寮完整的程序。实习生应当参观所有运作中的设备,包括摆放,质最控制(QC)和安全程序,不一定要操作设备,除非以后的职责将包括清洗和灭菌 |
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实验步骤 | 练习 概要 收集、漂洗、浸泡、清洗和灭菌玻璃器皿与吸管。 设备和材料 准备区的常规设备《见方案11.1~n.3)。 标准方案 l)玻瑞器皿的准备和灭菌(见方案11.1), 2)吸管的准备和灭菌(见方案11.幻。 3)螺口盖的准备和灭两(见方案11.3)。 补充方案:过滤装置的灭菌(见方案11.4) 数据 实习生要熟悉注意事项,记录质最控制数据,例如,烤箱和高压灭荫锅所显示的数字和图形。 |
实验方法原理 | 目的 纯水,火菌水的常规供应. 训练目标 在无菌区外正确地进行准备操作。了解水的纯化和制备过程的必要知识。 监份:间断的。 时间:30min. 背景信息 超纯水(UPW)的制备和灭菌(见 11.4节.图 5.17,图11.10)。 示范材料和操作:准备1几作的监督人要讲解水纯化设备的原理和操作,并示范操作收集、装瓶、灭菌及质旦控制的过程。实习生参与监督人和教师的评判。 |
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实验步骤 | 练习 概要 川高压灭菌锅灭菌纯水、试荆瓶。 标准方案 超纯水制备和灭菌(见方案11.5)。 补充方案:玻璃器lln的准备‘见方案11.1)。 数据 学习:水纯化过程中的电阻(或传导率)测定仪和总有机碳(TOC)测定仪。高压灭菌锅的自动打印愉出。中心试荆瓶的无菌指示器。 记录:在记录薄上记录正确的读数和观察结果。 分析 回顾间隔l周、1月、3月的记录薄数据,寻找水的质盆或火菌效果方面的趋势与变化。 |
实验方法原理 | 目的 在常压下使用的等渗盐溶液的制备。 应用 用于稀释浓缩液.如稀释2.5%腆蛋白酶;胰蛋自酶消化前的预漂洗,收集细胞或换试剂时的清洗溶液。因为它不含Can+和Mg汁,NaHCO3或葡萄糖,所以不适合长时间孵育。 训练目标 简单盐溶液的构成。渗透压.缓冲液和pH控制。利用高压灭菌锅消毒热稳定溶液。 监督:在培养溶液过程中连续监督,在质鼠控制步骤可以间歇监借。在灭菌的开始和完成阶段连续监督,在质旦控制数据阶段间歇监督。 时间:2 h 背景信息 盐平衡溶液(见9.3节;表9-2):缓冲液(见9.2.3节)。 示范材料和操作:渗压计或传钵率仪的使用。高压灭菌锅或台式高压灭菌器的指导使用。 安全提示:燕汽灭菌锅有很高的灼伤风险和可能的爆炸风险(见7.5.2,7.5.7节)。简单的台式高压火曲锅可能会F烧,因此有着火的风险,除非用自动的沮度控制切断器来保护。 |
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实验步骤 | 练习 概要 用超纯水溶解预混粉末或片刑,并用高珠锅灭菌。 标准方案 D-PBSA的制备(见方案11.6)。 QC 数据 学习:溶解组分后测址渗透床或传导率及 pH。 记录:在记录簿上记录时间和批号等细节。 |
实验方法原理 | 目的 制备一系列色阶,与实验室通常使用的比色卡很相似,含有简单的培养基或带酚红的盐溶液,调节其pH范围使之包含培养中常见的pH范围。 应用 在制备培养墓以及换液或传代前川于参照估计pH。 训练目标 熟悉酚红作为pH指示剂的使用.用注射式过渡器灭菌。 监督:开始时连续监督,在之后直到操作完成,可以减少监督。 时间:2h。 背景信息 物理化学特征,pH(见9.2节)。 示范材料和操作:pH计的使用。注射式过滤器的原理,澎”和容量(图 11.12a,c)。 安全提示:如果在注射器尖端没有针头的话就没有安全问题。 |
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实验步骤 | 练习 概要 制备一系列不同pH的溶液. 标准方案 使用 25 cm,的培养瓶制备pH标准色阶(见方案9.1和彩图221))使川注射式过滤器过滩灭菌(见方案11.11)。 |
实验方法原理 | 目的 制备复杂溶液及热不稳定试荆和培养钱的灭曲 训练目标 过滤的技术和容址的正确选择。比较正压和负珠过滤,监督:指导培养幕的制备。在过滤的初始阶段连续监督,在过滤过程中间歇监份,在抽样质量控制时连续监督。 时间:2h。 背景信息 以干粉配制培养地储液(见方案11.9).过滤灭菌(见11.5.2节.方案11.12);可供选择的步骤(见方案11.11, 11,13, 11.14)。 示范材料和操作:一次性滤器和反复装配使用滤器的容最,最好有实物,如果没有,照片也可以.强调滤器尺寸(表面积)的概念。正压/负乐滤器的原理和优缺点(见11.5.2节)。示范滤器的操作,过滤、收集、抽样质控。 |
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实验步骤 | 练习 概要 在超纯水中溶解粉末,过滤灭菌,分装到试剂瓶,抽样进行无菌测试。 标准方案 1)以粉未配制培养篆(见方案11.9)。 2)用真空过滤器过滤灭菌450 ml 培养基(见方案11.12)。 3)用正压过滤器过滤灭菌550 ml 培养基(见方案11.13)。 补充方案:特殊培养基的配制(见方案11.10);高压灭菌培养基(见11.5.1节);可反复使川的灭菌滤器(见11.3.6竹);使用注射式滤器的过滤灭菌(见方案11.11). 用大型直线式过滤器过雄灭菌(见方案11.14);血清(见11.5.3节;方案n.15)。 实验变化 将溶解的培养基分成两份.用正压过滤器过滤灭菌550ml培养基(见方案11.13),用负压过滤器过滤灭菌45oml培养基(见方案11.12)。 背景:C(入和碳酸氧盐(见9.2.2节);缓冲液(见9.2.3竹);标准灭菌方案(见11.5竹)。 数据 l)注意过滤之前和之后瞬时的pH. 2)在37t孵育普通的容器或试剂瓶1周,检在污染物。 分析 1)解释真空过滤器和正压过建器过滤的培养基pH的不同。 2)储存一段时间后pH是否会恢复? 3)何时要有选择的使用培养幕? 4)你会选择什么样的滤器 a)过滤 5ml 结晶的溶液? b)过滤 10L 培养基? c)过滤 1L 血清? |
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