一、标准琼脂糖不同浓度分离DNA片段的范围 琼脂糖/% 分辨DNA大小的范围
0.5 700bp~25kb 0.8 500bp~15kb 1.0 250bp~12kb 1.2 150bp~6kb 1.5 80bp~4kb
二、电泳缓冲液配制 以Tris-乙酸盐和EDTA缓冲液(pH8.0,TAE)为例 缓冲液 工作液 贮存液/L
TAE 1X 50X 40 mmol/L Tris-乙酸盐 242g Tris 1 mmol/L EDTA 57.1ml 冰乙酸 100 ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
三、琼脂糖凝胶制备 1. 将清洁干燥的塑料托盘放入配胶板,置于水平面上。
2. 配制足量的电泳缓冲液(1XTAE)用以灌满电泳槽和配制凝胶。
3. 根据欲分离DNA片段大小用电泳缓冲液配制适宜浓度琼脂糖溶液:准确称量琼脂糖干粉加到盛有定好量的电泳缓冲液的三角烧瓶或玻璃瓶中。
4. 在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。
5. 用隔热手套或夹子转移三角烧瓶或玻璃瓶到55℃水浴。待熔化的凝胶稍冷却后加入溴化乙锭,终浓度为0.5 μg/ml。轻轻地旋转以充分混匀凝胶溶液。
6. 琼脂糖溶液正在冷却时,用一个合适的梳子形成加样孔。梳齿的位置应在托盘底面上0.5~1.0mm,这样琼脂糖浇灌到托盘时将形成符合要求的加样孔。
7. 浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具,室温下放置30~45min,待凝胶溶液完全凝结,小心拔出梳子。
四、DNA电泳 1. 将凝胶安放在电泳槽内,向电泳槽加入电泳缓冲液,刚好没过凝胶约1mm。
2. 混合DNA样品和一定比例的载样缓冲液。
3. 用微量移液器及一次性吸头将样品混合液缓慢加至浸没凝胶的加样孔内。分子质量标准应分别加至样品孔的左侧和右侧的两个孔内。
4. 关上电泳槽盖,接好电极插头。DNA应向阳极(红色插头)侧泳动。给予1~5V/cm的电压,其中距离以阳极至阴极之间的测量为准。
5. 当DNA样品或染料在凝胶中迁移了足够距离时,关上电源、拔出电极插头和打开电泳槽盖,用紫外灯观察凝胶和拍照。 |