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标签： 赖氏法 血清丙氨酸转移酶（ALT）测定实验
通过此实验使学生掌握ALT测定的原理.试剂配制方法，本实验来源于牡丹江医学院本科5年制检验专业实验指导
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| 实验方法原理 |
 经30min反应后， 加入2、4-二硝基苯肼终止反应，并与反应液中的二种a-酮酸生成相应的2、4 二硝基苯腙、在碱性条件，两种苯腙的吸收光谱曲线有差别，在500－520nm处差异最大， 以等摩尔浓度计算，丙酮酸苯腙的显色温度约为a-酮戊二酸苯腙的3倍. 据此计算出丙酮酸的生成量． |
|---|---|
| 实验步骤 |
一、实验试剂： l. 0.1mol/L磷酸氢钠溶液：磷酸二氢钠（含二个结晶水）17.8g溶于水中并加水至1000ml，冰箱内保存。 2. 0.1mol/L磷酸二氢钾溶液：磷酸二氢钾13.6g溶解于水中，加水至1000ml，冰箱内保存。 3. 0.lmol/L磷酸盐溶液（PH7.4）：将420mol 0.1L磷酸氢钠溶液180ml 0.1moL/L磷酸二氢钾溶液混匀，加氯仿数滴。置冰箱内保存。 4. 底物缓冲液（DL-丙氨酸200 mmol／L.a-酮戊二酸2 mmol／L）：精确称 取1.79gDL丙氨酸和29.2 mg a-酮戊二酸先溶于约50 m1 0.1mol/L磷酸盐缓冲液中用l mol/L氢氧化钠（约0.5 ml）调节至PH 7.4 在加磷酸盐缓冲液至100 ml，置冰箱保存.可稳定2周，每升底物缓冲液可加入麝香草酚0.9g或加氯仿数滴防腐，置冰箱中至少可保存1个月，分装安瓶灭菌后，室温至少可用3个月。 5. 1.0 mmol/L 2，4-二硝基苯肼溶液：称取19.8mg，2，4硝基苯肼，溶于10mmol/L的盐酸中．完全溶解后，加蒸馏水至100ml，置棕色玻璃瓶，室温中保存若有结晶析出，应重新配制。 6. 0.4mol／L氢氧化钠溶液，将 16.0g氢氧化钠溶解于水中，并加水至 1000ml，置具塞塑料试剂瓶内，室温中可长期稳定。 7. 2mmol/L丙酮酸标准液：准确称取22.0mg丙酮酸钠（AR）置于100ml，置容量瓶中加0.05mol／L 硫酸至刻度。 二、实验操作：在测定前取适量的底物溶液在37℃水浴箱内预温5min后使用，具体操作接表1进行．  各管温匀后，在37℃水浴保温20min，然后各管加人0.4mol/L氢氧化钠溶 液5ml，室温放置5min，用分光光度计在波长505nm处以蒸馏水调零点，读取各管吸光度，测定管吸光度减去样本对照管吸光度，从校正曲线查得ALT活力单位。 标准曲线绘制 1. 按表2向各管加入相应试剂  2. 各管加人2，4二硝基苯肼溶液0.5ml，混合37℃20min后加入0.4mol/L 氢氧化钠溶液5ml。 3. 根匀，放置5min后用分光光度计在波长505nm处，以蒸馏水调零点，读取吸光度，各管吸光度减去“0”号管吸光度所得差值所对应的卡门酶活力单位做图。 参考值：5-25卡门单位 |
| 注意事项 |
1. 赖氏比色测定由于受底物a-酮戊二酸浓度和2，4二硝基苯肼浓度的不足以反应产物丙酮酸的反馈抑制等因素的影响，标准曲线不能在延长至200卡门单位。 2. 血清中ALT在室温（25℃）可以保存2天，在4℃冰箱可保存一周，在25℃以下可保存一个月。 3. 严重脂血，黄疸或溶血血清可能会引起测定管吸光度增高，因此，检测此类标本时，应做血清标本对照。 4. 当血清标本酶活力超过150卡门单位时，应将血清用生理盐水稀释5倍或10倍后再进行测定。 5. 加人2,4-二硝基苯肼溶液后，应充分混匀，使反应完全，加入氢氧化钠溶液的速度要一致，不同的加入速度会导致吸光度读数的差异。 6. 底物中的a-酮戊二酸和2,4-二硝基苯肼均为显色物质，称量必须很准确，每批试剂的空白管吸光度上下波动范围不应超过0.015A如超过此范围，应检查试剂及仪器方面问题。 7. 成批ALT测定时各管加入血清后，试管架应置37℃水浴中操作，以一定的时间间隔各管加人底物缓冲液，每管即时混匀，以加人第一管开始计时，准确每反应30min。立即依相同的时间间隔，依次向各管加人2,4二硝基本肼亦每管即时混合，这样，才能保证成批ATL测定的准确性。 |
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