一、LB培养基配制(固体培养基加2%琼脂粉) 酵母粉Yeast Extract 5g 蛋白胨Peptone/g 10g NaCl 10g 水 1000ml
二、TFBI溶液配制 RbCl(氯化铷) 5 g 1 M KAc(醋酸钾) 12.3 ml 1 M CaCl2(氯化钙) 4.1 ml 1 M MnCl2(氯化锰,粉色) 20.5 ml glycerol(甘油) 61.5g 0.1 M HAc(醋酸) 8 ml 调节pH至5.8 超纯水 补足至410ml 注:配制完成后用0.22μm滤膜过滤除菌。
三、TFBII溶液配制 1 M MOPS (pH 6.5,溶液为黄色) 1.5 ml 1 M CaCl2(氯化钙) 11.25 ml 1 M RbCl 1.5 ml glycerol(甘油) 22.5 g 1 M KOH(氢氧化钾) 调节pH至6.5 超纯水 补足至150ml 注:配制完成后用0.22μm滤膜过滤除菌。
四、高效感受态细胞制备 1. 取实验室-80度保存的DH5α菌种在无抗性的LB平板上划线,37度培养过夜,进行活化。; 2. 从LB平板上挑取单菌落,尽量选择菌落较饱满,边缘平滑,个头较大、长势较好的菌落; 3. 挑选上述单菌落接种于装有10ml无抗性LB液体培养基的25ml锥形瓶中; 4. 37℃下振荡培养过夜(摇床转速200rpm,12h左右),进行充分活化; 5. 将上述菌液以1:100的比例接种到大的锥形瓶中,37℃振荡培养2~3h至OD590达0.4~0.6; 6. 将培养好的菌液转入洁净无菌的50mL离心管中,冰上放置10min(此时,可以将配置好的TBFI溶液冰浴预冷了,离心机也要开始预冷了,如果你们的离心机降温较慢,最好再提前一点); 7. 在4℃下,4000rpm离心10min,弃去上清; 8. 加入初始细菌培养基1/2.5的冰上预冷的TBFI溶液(如果前面使用的是60ml,这里则为60/2.5=24ml),轻轻悬浮细胞,冰上放置10min; 9. 4℃,4000rpm离心10min,弃去上清; 10. 加入初始细菌培养基1/25体积的预冷TBFII(如果前面使用的是60ml,这里则为60/25=2.4ml,也即为TBFI的1/10,当然具体体积也可以根据个人经验上下变动),轻轻悬浮菌沉; 11. 分装至EP管中,每管分装100ul(EP管最好预冷,分装过程要求在冰上进行); 12. -80度长期保存(至少可以保存一年). |