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大肠杆菌转化实验

标签: 大肠杆菌 转化

大肠杆菌转化可以:(1)将重组DNA分子导入大肠杆菌受体细胞进行复制,增殖和表达,以获得目的基因;(2)验证大肠杆菌感受态细胞效果;(3)用于分子生物学其他研究。

详细
实验方法
  • 热击法
  • CaCl2转化法
  • 一步法
  • 高效率电转化法
实验方法原理 质粒DNA或重组DNA粘附在细菌细胞表面,经过42°C短时间的热击处理,促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代,待质粒上所带的抗菌素基因表达,就可以在含抗菌素的培养基中生长。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
一、实验材料准备

1.  器材
 
旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,1.5 ml 微量离心管,双面微量离心管架,干式恒温气浴(或恒温水浴锅),制冰机,恒温摇床,培养皿(已铺好固体LB-Amp),超净工作台,酒精灯,玻璃涂棒,恒温培养箱。
 
2.  试剂
 
培养基(不加抗菌素),LB培养基(加抗菌素),无菌ddH2O,IPTG,X-gal。
 
3.  材料处理

无菌ddH2O,1.5 ml 离心管装入铝制饭盒(灭菌)、移液器吸头装入相应的吸头盒(灭菌),20%IPTG(M/V),2% X-gal(M/V,用N,N-二甲基甲酰胺配)。
 
二、操作步骤
 
1.  事先将恒温水浴的温度调到42℃。
 
2.  从-70℃ 超低温冰柜中取出一管(100 μl)感受态菌,立即用手指加温融化后插入冰上,冰浴5~10 min。
 
3.   加入5 μl 连接好的质粒混合液(DNA含量不超过100 ng),轻轻震荡后放置冰上20 min。
 
4.  轻轻摇匀后插入42℃水浴中1~2 min进行热休克,然后迅速放回冰中,静置3~5 min。
 
5.  在超净工作台中向上述各管中分别加入500 μl LB培养基(不含抗菌素)轻轻混匀,然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1 h。
 
6.  在超净工作台中取上述转化混合液100-300 μl,分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。
 
7.  如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话,滴完菌液后再在平板上滴加40 μl 2% X-gal,8 μl 20% IPTG,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。
 
8.  在涂好的培养皿上做上标记,先放置在37℃恒温培养箱中30~60 min 直到表面的液体都渗透到培养基里后,再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。
 
9.  在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇,擦干桌面,写实验报告。
 
10.  观察平板上长出的菌落克隆,以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。
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注意事项
1.  玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻,待其冷却后再涂。
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实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
1.  接种—个单菌落于50 ml LB培养液中,于37℃摇床培养过夜(250 r/min)。

2.  往一个2 L 的烧瓶中加入400 ml LB培养液,再加入4  ml 过夜培养液,于37℃;摇床,培养至OD590为0.375。

3.  将培养液分装到8个50 ml 预冷无菌的聚丙烯管中,于冰上放置5~10 min,然后于4℃,1 600 g 离心7 min。
 
4.  细胞沉淀用10 ml 冰冷的CaCl2“溶液重悬,于4℃,以1 100 g 离心5 min 。

5.  细胞沉淀用10 ml 冰冷的CaCl2溶液重悬,冰上放置30 min,于4℃,1 100 g 离心5 min。
 
6.  用2 ml  冰冷的CaCl2溶液重悬各管细胞,然后按每管250 μl 的量分装于预冷的无菌聚丙烯管中,立即冻存于- 70℃。

7.  按照以下各步骤用10 ng pBR322转化100 μl 感受态细菌。

8.  将合适体积的转化物涂于含有氨苄青霉素的LB平板上,37℃培养过夜。

9.  将10 ng 加入到一个15 ml 无菌的圆底试管中,并放置冰上。

10.  将盛有感受态细胞菌的管子握在手上使菌液迅速熔化。

11.  立即将100 μl 感受态细菌加 入到管中,轻轻旋动,并放置冰上10 min 。

12.  将管故入42℃水浴2 min 进行热休克,然后加入1 ml LB 培养液于每一支试管中。

13.  于37℃置滚筒式摇床口培养1 h。

14.  将几个稀释度菌液涂布于含合适抗生素的平板上,于37℃培养12~16 h。
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实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
1.  按1:100的比例将过夜培养的菌液如人到新鲜的LB培养液中,于37℃培养至为OD600为0.3~0.4。
 
2.  加入等体积的2×TSS于菌液中,在冰上温和地混匀。
 
3.  将100 μl 感受恣细菌和1~5 μl DNA加入到一个冰冷的聚丙烯管或玻璃管中,4℃放置5~60 min。

4.  加入0.9 ml 含20 mmol/l 萄糖的LB培养液,37℃温和振荡培养30~60 min 在合适的平扳上挑选转化体。
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实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
1.  接种一个单菌落于5 ml LB培养液,37℃温和振摇培养5 h 或过夜。

2.   将2.5 ml 培养物加人到盛有500 ml LB培养液的2 L 烧瓶中,37℃摇匀振荡培养至OD600为0.5~0.6。
 
3.  细菌在冰水浴冷却10~15 min,然后转移到预冷的1升离心瓶中。于2℃,5 000 g 离心20 min 沉淀用5 ml 预冷的水溶解6。

4.  加入500 ml 冰冷的水,混匀,按步骤3重复离心1次,立即将上清倒掉,用残余的液体重悬细胞。
 
5.  新鲜制得的细菌

(1)将悬浮液加入到预冷的50 ml 聚丙烯管中,2℃,5 000 g 离心10 min。

(2)估计细胞沉淀的体积,沉淀用等体积的冰冷水重悬。

(3)按50~300 μl 分装于预冷的微量离心管中。

6.  冻存细菌

(1)加入40 ml 冰冷的10%甘油,混合,然后按照步骤5离心。

(2)估计沉淀的体积,然后加入等体积的冰冷的10%甘油,重悬菌体。

(3)按50~300 μl 分装于预冷的微量离心管中。

(4)于干冰上冷冻并贮存于-80℃。

7.  将电转化仪调到2.5 kV、 25 μF ,脉冲控制器调到200~400Ω。

8.  将1 μl 质粒DNA加入到盛有新鲜制备的细菌或融化的冻存细菌的小管中,混匀。
 
9.  将转化混合物转移到预冷的电转化池中,吸干池的外表面,然后放入样品槽中。
 
10.  进行脉冲电转化,然后取出电转化池,马上加入1 ml SOC培养液,并且用巴斯德吸管转移到无菌的培养管中。

11.  于37℃,中速振荡培养30~60 min。

12.  分小份涂布于含有抗生素的LB平板上。
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最新实验心得
(共3个心得)
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    big_lotus: 血凝块中提取基因组DNA

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实验问答
(共15个问题)
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