标签: 硝酸还原酶 活力测定 活体法
硝酸还原酶活力测定可以用于:测量其催化植物体内的硝酸盐还原成亚硝酸盐的效率。
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1. 标准曲线制作
取7支洁净烘干的15ml刻度试管按表13-1顺序加试剂,即配成0-2.0μg的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在30℃保温箱或恒温水浴中保温30min,然后在540nm波长下比色。以亚硝态氮(μg)为横坐标,光密度值为纵坐标绘标准曲线或建立回归方程。
表13-1 各试剂加入顺序
2. 酶反应和酶活性测定
(1)取样:将材料(小麦、玉米等作物叶片)洗净,用蒸馏水冲洗,滤纸吸干。在叶片中部打取直径1cm的圆片(或剪成0.5——1.0cm2的小块),混匀后每个样品称0.5——1.0g 3份,放入试管并编号。
(2)反应:向各试管加入KNO3·异丙醇·磷酸缓冲液混合液9ml,其中一管立即加1.0ml三氯乙酸混匀作对照。然后将所有试管置真空干燥器中接真空泵抽气,反复几次直至叶片沉在管底。将各试管置30℃下于黑暗处保温30min,分别向处理管加1.0ml三氯乙酸,摇匀终止酶活性。
(3)比色:将各试管静置2min,吸取上清液2ml加入另一组试管,以对照管做参比,按标准曲线做法进行显色测定,并计算酶活性(Nμg·g-1·h-1)。
式中 C:反应液催化产生的亚硝态氮总量(μg);
V1:提取酶液时加入的缓冲液体积(ml);
V2:酶反应时加入的粗酶液体积(ml);
W:样品重量(g);
t:反应时间(h)。
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