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实验方法原理 | 利于皮肤表皮细胞实验">培养成功的因素有,在有胶原的底物上易生长;另有人发现把人或小鼠表皮细胞培养在以3T3 细胞为饲养层(用射线照射后)上时,细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低pH、Ca2+的含量和温度等,均利于表皮细胞生长。向培养基中加氢化可的松( 10 μg/ml )、10-10 的霍乱毒素、10M-6 的异丙基肾上腺素(Isopro-terenol)和10 ng/mI 促表皮生长因子(EGF)能促表皮细胞生长。 |
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实验材料 | |
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实验步骤 | 皮肤是皮表细胞培养来源,小儿包皮是皮肤表皮细胞培养的好材料。全皮培养时,表皮细胞与成纤维细胞混合生长,难以纯化。黑木登志夫(1981)用皮肤表皮和真皮分离培养法可获纯上皮细胞,有一定参考价值,其法如下:
1. 取材
取外科植皮或手术残余皮肤小块,以角化层薄者为佳,早产流产儿皮肤更好,切成 0.5~1 平方厘米小块; 2. EDTA处理 先置入0.02 %EDTA 中室温置5 分钟; 3. 冷消化 换入0.25 %胰蛋白酶中,置4 ℃过夜; 4. 分离 取出皮块,用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开; 5. 温消化 取出表皮单独处理,用剪刀剪成更小的块后,置入新的0.25 %胰蛋白酶中,37 ℃再消化30~60 分钟; 6. 用吸管轻轻反复吹打,使成细胞悬液; 7. 培养液 通过80 目不锈钢纱网滤过后,低速离心,吸上清,直接加入Eagle液和 20 %小牛血清,制成细胞悬液,接种入碟皿中,CO2温箱培养。 |
注意事项 | 冷消化目的在于使表皮和真皮结合松散,如冷消化后分离下来的表皮膜自身也已松散,此时亦可直接置入PBS中用吸管吹打制备细胞悬液;不再经过第二次消化。 |
其他 | 皮肤表皮培养亦可用全皮消化法或组织块培养法培养。用胶原酶消化为好,它对结缔组织有较强消化作用,对表皮细胞损伤小,但成纤维细胞易与上皮细胞同时生长,在这种情况下,需做排除成纤维胞处理。血清中含有血小板来源的生长因子(PDGF),易促成纤维细胞的生长;如用好的、不含PDGF的无血清培养基培养可能更好。 |
实验方法原理 | 乳腺主要由腺上皮组成,培养成功时可获纯上皮细胞培养物。乳腺材料易于获得,既可培养正常乳腺,也可利用乳腺癌组织。乳腺组织不难培养,是很好的培养和研究对象。 |
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实验材料 | |
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实验步骤 | 一、取材 培养正常乳腺可从乳腺切除组织或乳腺成形术组织取材。预先把无菌容器送交手术室(最好含有培养液),委托术者选脂肪少、腺组织多的部位,切取少许,送培养室立即进行培养。获取组织后,应先剥除脂肪组织;培养正常乳腺组织宜用胶原酶消化法。培养乳腺癌组织可采用两种方法。
二、培养程序 1. 直接培养法 适于培养含纤维少的软组织,其主要过程是 (1)在含有少量培养液或Hanks液的容器中,用锋利刀片将组织反复切割成碎块(或用剪刀剪切)。 (2)把组织碎块连同液体注入离心管中,再补加少许培养液,用吸管吹打片刻,置试管架中3~5 分钟。 (3)此时乳腺细胞团或单个细胞大多沉降至管底,而脂肪或其它含纤维多的碎块悬于液体上部;吸除上层液可排除非腺细胞成分,如此可重复2~3 次。 (4)末次处理结束后,向沉降管中再补加培养液,用吸管稍吹打,使沉降物重悬。 (5)不待细胞团块下降立即通过3~4 层无菌沙布滤入另管中。调整好适宜密度,接种入培养瓶中培养。 2. 胶原酶消化法 适于处理含纤维多的较硬组织,其过程与培养其它组织相同。 |
其他 | 一、讨论 1. 上皮细胞和间充质关系密切,已证明上皮细胞生长和分化因子来源于间充质。 在体内,上皮细胞生长在由胶原组成的基膜上,基膜含有胶原蛋白、附着蛋白和氨基多糖;在体外培养时,上皮细胞和间充质依存关系仍然存在。 上皮细胞生长在胶原上比生长在其它底物上效果更好。正常上皮细胞与其它组织相互依赖性大,较难培养。 考虑到这些特点和采取相应措施,有助于提高培养成功率。 2. 在初代培养成功后,为进一步获取乳腺细胞培养的成功,主要需解决刺激乳腺细胞持续生长问题。 只有旺盛的细胞生长,才能压制成纤维细胞,获得纯上皮细胞培养物。 其次是生长后的乳腺上皮细胞对底物(特别是塑料底物)附着甚牢不易解离,不利于制成细胞悬液进行传代。 为克服这些障碍,当前多采用以下一些措施:在接种底物上铺以胶原层较好,既利乳腺细胞生长,也易使细胞分离。 有人还证明培养在胶原上的乳腺细胞比生长在塑料底物上的同样细胞对固醇类激素更易发生反应。 此外,也可在胶原层上再接种饲细胞,对压制成纤维细胞和促乳腺上皮细胞生长也有作用。 其次为选用适宜的培养条件,是乳腺上皮细胞培养的另一重要因素。 使用无血清培养基MCDB202 再补加牛垂体浸出物效果甚好。或用更加完善的无血清培养基MCDBl70,再加上皮细胞生长因子(EGF)、胰岛素、氢化可的松、猪促乳素和前列腺素E1 等,不论对正常乳腺上皮细胞或乳腺癌细胞,都有极好的促生长效应。 在不能得到像MCDB 这种培养基的情况下,—般使用Eagle 或1640 等培养基和小牛血清,再补加胰岛素、氢化可的松等,都利于乳腺上皮细胞生长。 |
实验方法原理 | 胃癌为我国高发癌症之一,培养正常人胃上皮细胞对研究胃癌癌变机理有很大应用价值。近年来培养人的肾脏上皮、气管上皮、前列腺上皮等都有报道,但培养人胃上皮细胞少见成功。近年我研究室通过培养90例正常胃上皮细胞初代培养获得成功,并建成转化细胞系(Ges-1)。
培养人正常胃上皮细胞获得成功主要在于摸索到了适于胃上皮细胞生长的条件,它们主要是
1. 胶原酶和透明质酸酶消化法并用消化细胞; 2. 应用胶原底物培养; 3. 制备含有特定成分的培养基。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 一、培养条件的准备 1. 基础培养基 DME/F12(Sigma 产),加庆大霉素100 U/ml,pH7.4 2. 完全培养基 (1)在基础培养基中再附加相关促细胞生长因子和其它成分 胰岛素(Sigma 产) 5 μg/ml
转铁蛋白(Sigma 产) 10 μg/ml
新生牛脑提取物 10 μg/ml
(2)新生牛脑提取物制法
①取新生牛脑垂体110 g/mlHEPES缓冲液匀浆; ②10000 转,离心20 分钟,取上清; ③水中透析2 天,透析袋为#08667B(Fisher 产); ④10000转,离心20 分钟,取上清; ⑤0.22 微米微孔滤膜滤过除菌,-70 ℃贮以备用。 3. 细胞外基质(ECM) IN型胶原 8 μg/ml
纤粘连蛋白 10 μg/ml
层粘连蛋白 8 μg/ml
多聚赖氨酸 0.001 %
酵母提取物(Sigma) 5 %
将以上混合物用弯头吸管涂于塑料培养皿表面
4. 消化酶 I型胶原酶(Sigma) 0.5 %(用DME配)
透明质酸酶(Sigma) 0.5 %(用DME配)
二、培养程序 1. 取材 取胃溃疡或胃癌手术切除胃标本远端非病变区粘膜少许; 2. 清洗 用含庆大霉素(400 μg/ml)和二性霉素(2 μg/ml的Hanks)液漂洗后,用钝器剥离下粘膜,剪成1 mm3大小; 3. 消化 在I型胶原酶和透明质酸酶中,于37 ℃中消化80 分钟; 4. 离心 收集细胞悬液,800 转/分,离心后,Hanks液漂洗两次; 5. 接种 末次离心后加入含有1 %~2 %胎牛血清的完全培养基,接种入不同孔数的培养板中;接种量依不同实验目的而定。 细胞接种后一般在16 小时内贴壁,细胞呈多角形,成岛状或片状生长,以后逐渐联接成片。初代培养可维持2~3 周,第一周末达高峰,最后逐渐衰退剥落。 |
其他 | 一、讨论 胃上皮细胞培养中证明,多加血清并不能提高促细胞生长作用,是因血清中除含有促细胞生长的PDGF因子外,也含有TGF-β1。我们研究证明TGF-β1有抑制上皮细胞生长作用。但因完全培养基中含有较多促上皮生长因子,仍利于上皮细胞生长。上皮细胞生长对ECM有依赖性,其中以N型胶原对胃上皮细胞作用更好。 |
实验方法原理 | 肝实质由大量肝细胞和少量间质组成,人胎儿、成人和动物的肝脏皆可用于培养;肝脏具有取材方便和易于生长的优点,能获得典型上皮细胞培养。肝细胞形态规整,有多种功能并具有代谢活化致癌物的能力,适用做多种研究;我国已建有多个人肝癌细胞系。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 一、初代组织块培养 肝组织做组织块培养效果很好。取新鲜肝脏,先剥除被膜和血管等纤维成分,用刀或剪刀把肝剪成1 mm3左右的小块,采用贴壁培养法。肝组织易于贴壁,生长力好,一般次日即可出现生长晕。
二、初代消化法培养 1. 把肝组织切成2~4 立方毫米的小块,用不含钙镁的BSS液洗两次。
2. 移入1:1 的0.1 %胰蛋白酶和0.1 %胶原酶(都用无钙镁BSS配制)中,4 ℃冷消化10~12 小时后,通过250 微米和64 微米尼龙网或不锈钢纱网滤过(用纱布滤过亦可)。 3. 收集细胞、BSS液洗1~2 次、计数、接种培养。 消化培养肝细胞的另一种方法是灌流法:肝脏灌流需用全肝,以较小动物如小鼠和大鼠为好。 1. 无菌解剖动物,取出肝脏,先用BSS洗除血污。 2. 取5 ml注射器一支,吸取消化液后,把注射器头轻轻插入肝管中,用线绳结扎牢固,以防消化液漏出,轻轻把消化液注入胆管系统,并不时轻柔压肝脏,以便消化液进入肝小叶中;消化液在肝内停留20~30 分后,在吸出消化液的同时并轻柔压肝脏,以使肝细胞脱落和消化液吸出。 3. 待吸净消化液后,注入离心管中,低速离心分离,用RPMI1640培养基培养(较其它培养基为好),能获得较纯的肝上皮细胞和获较好的效果。 三、传代培养
待细胞生长连接成片后,用BSS洗一二次,加1:1的0.025 %胰蛋白酶和0.02 %EDTA混合消化3~5 分钟,待细胞回缩,便停止消化,弃掉消化液、用BSS洗一二次,注入营养液、吹打、制成细胞悬液、再接种培养。
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实验方法原理 | 内皮细胞易于从血管分离进行培养成单层细胞,对研究内皮细胞再生生、肿瘤促血管生长因子(TAF)等有很大应用价值。人内皮细胞培养可应用人脐带脐静脉、动物大动脉等,用灌流消化法获取细胞最为简便。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
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实验步骤 | 1. 取产后的新鲜脐带;如不立即培养可保存于4 ℃中,但不宜超过12 小时;无菌剪取长10~15 厘米一段。其它如胚胎和幼体动物的大血管,亦可用于培养;
2. 先用三通注射器吸温PBS液注入脐带的脐静脉中,洗除残血;注入口处宜用线绳结扎,以防液体返流; 3. 用血管钳夹紧脐带一端,从另端向脐静脉中徐徐注入最终浓度为0.1 %的胶原酶,待末端出现液体后结扎之,令充满血管,注入口应应结扎,以防液体返流,消化3~10 分钟; 4. 吸出含有内皮细胞的消化液,注入离心管中;为获取更多细胞,可再注入温PBS冲洗2~3 次彻底清除干净残余细胞,一并注入离心管中离心; 5. 吸除上清,加1640培养液,制成细胞悬液,接种入瓶皿中培养,顺利时2~3 天内细胞即可长成单层。 |
其他 | 一、讨论 内皮细胞生长后,开始细胞成梭形,类成纤维细胞,连接成片后始显内皮细胞形状。 首次用胶原酶消化时,应做预试验,以找出最佳消化时间,以防止消化不足细胞未脱落,也避免因消化过度使内皮细胞底层成纤维细胞混入。我们曾试用胰蛋白酶消化,效果远不如胶原酶好。 人脐带易于获得,培养效果好;细胞生生后,一般传6~7 代后即衰退,难以长期维持。 用兔血管内皮细胞培养较好,可传10~30 代;不同部位血管内皮细胞生物学性状不同,对各种作用因素反应亦有很大差别。 |
实验方法原理 | 毛细血管内皮细胞在形态上与心血管系统其它部位内皮细胞相似,但实验证明,在生物学性状上却大不相同,不能相互代替,因此必须单独进行培养。毛细血管细小,结构简单,内皮细胞外有较多的结缔组织,进行分离培养有很大困难。近年毛细血管培养已获成功;材料取自血管丰富组织,利用人的小儿包皮、人脾脏、牛肾上腺、癌组织(如卵巢癌)等均可。 |
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试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 一、材料 1. 肿瘤条件培养基制备
(1)取C3H小鼠的S-180 实体肉瘤组织;
(2)胰蛋白酶消化,Dulbecco改良Eagle氏培养液15 ml(含10 %小牛血清),接种到T-75 Falcon产培养瓶中培养; (3)在细胞生长接近完全汇合时,收集培养液制成条件培养基;再用含10 %小牛血清的新培养液后,也每隔两天收集一次,可获多量条件培养基; (4)4000 转/分,离心后,再通过0.22 μm微孔滤膜滤过,-20 ℃冻存备用(临用前融解)。 2. 凝胶底层制备 (1)取60 mm Falcon产培养皿,加1 %Difco产明胶(用不含钙和镁的Hanks液配制),铺盖瓶底,形成薄层; (2)置4 ℃过夜;用前再用不许培养液冲洗一次。 二、初代培养 (1)取材 取新鲜牛肾上腺数个,先用Hanks液洗除血污; (2)剥除被膜,分离出皮质,切成1 立方毫米小块,加0.5 %胶原酶室温中消化1 小时;每隔10 分钟用吸管吹打悬液令消化充分; (3)通过不锈钢纱网滤过,网眼要求只允许能通过小于110 微米长的毛细血管小段; (4)650 rpm,4 ℃,离心7 分钟后,弃掉上清胶原酶; (5)沉淀物用培养液重悬并离心,再重悬,再离心,共两次; (6)末次沉淀物仍用含10 %小牛血清的Dulbecco改良Eagle 氏培养液重悬后,稍吹打; (7)接种入铺有明胶底层的培养皿中,37 ℃培养;在培养头1~3 小时中,毛细血管小段和内皮细胞最先贴附于底物上,而肾上腺细胞和成纤维细胞却仍在培养液中漂浮; (8)趁此时,吸除培养液,再加入肿瘤条件培养液;每两天换液一次。毛细血管小段一般成自1~4 个内皮细胞,以后每个小段在底物上慢慢展成特殊形态的细胞岛,能持续2~5 天。 三、毛细血管内皮细胞分离培养 毛细血管细胞初代培养细胞往往杂有其它非内皮细胞成分,此时需进一步纯化。原理与培养肿瘤细胞时排除成纤维细胞类似,可采用机械刮除法。但刮除其它细胞后,剩余毛细血管内皮细胞岛有时数量很少,此时细胞很给生长增殖,需用特殊饲细胞法等才易成功。 (1)初代培养2~3 天后,镜下确认几个毛细血管内皮细胞岛,在培养皿背面,用不脱色笔划圈圈起; (2)镜下检查,如圈内残有非内皮细胞时,可用显微细针在倒置显微镜下挑除;此操作用细胞解剖器或用手操做均可,宜在净化台无菌气流中、打开培养皿盖进行,但时间不宜过长(15~20 分钟);圈外非内皮细胞可用无菌胶刮刮除; (3)用培养液漂洗两次,以去除漂浮细胞; (4)剩余内皮细胞岛如小(5~20 个细胞)而少时,生长增殖常变得缓慢或完全不生长,此时需加入3T3 等饲细胞;饲细胞接种量为4000 细胞/cm3; (5)当内皮细胞充满所有饲细胞空间后,用胰蛋白酶消化、离心、加入肿瘤条件培养基; (6)接种入明胶底物皿中继续培养(饲细胞死亡命被淘汰),细胞增殖生长汇合后,按1:5 传代。 |
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