标签: 细胞 冻存 实验
细胞冻存实验可以用于:(1)妥善贮存细胞;(2)维持细胞生存;(3)节约人力、物力、时间及减少污染机会;(4)维持细胞发生遗传性状的稳定。
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细胞生长至对数晚期,以培养基制备高浓度细胞悬液,加入细胞保护剂,等份转移至冻存管中,缓慢冷冻。
细胞冻存时向培养基中加入保护剂,即终浓度5%.15%的甘油或二甲基亚砜(DMSO),可使溶液冰点降低,加之在缓慢冻结条件下,细胞内水分透出,减少了冰晶形成,从而避免细胞损伤。 采用"慢冻快融"的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1 到 -2℃/min,当温度低于-25℃时可加速,到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。
1. 肉眼及显微镜观察,确保细胞满足冷冻标准。
2.使细胞生长至对数生长晚期,若为贴壁细胞,用胰酶消化,并进行细胞技数。若为悬浮生长细胞,进行细胞计数并离心。
3.悬浮细胞的浓度为:2×106个~2×107个细胞/ml。
4.将以下任意一种细胞保护剂加入到生长培养基中,配制冻存液:
(a) 加10%~20%的二甲基亚砜(DMSO)或(b)加20%~30%甘油。
5. 用冻存液将细胞悬液按1:1的比例稀释至细胞度浓约为1×106 ~1×107 /ml ,此时DMSO的浓度为5%-10%(或甘油浓度为10-15%)。建议勿将冻存管置于冰上,减少细胞退化。使用DMSO时,室温操作30min是无害的,当使用甘油时,则对细胞是有益的。
6. 将细胞悬液分装至预先标记好的冻存管中,盖上盖子,拧紧,密封,注意不要太紧,避免螺旋扭曲变形。
7. 将冻存管夹在铝条上,装入储存筒中,或将其松散地排列在抽屉储存器中。
8. 将冻存管通过上述方法之一以1℃/min的速率进行冷冻。使用隔热保温的方法,使冻存管达到-70℃,若最初温度为20℃,则需4~6h,但最好于-70℃过夜。
9.当冻存管温度达到-70℃或更低时,在将其从-70℃或能控制冷冻速率的冷冻柜中转移出来之前,检查冷冻记录,确定液氮罐中存放冻存管的合适位置。
10. 将冻存管转移至液氮冷冻罐中,最好不要使其浸没在液氮中,将放油冻存管的铝条和纸质管放入预先确定的储存筒中,或将个别冻存管放入预先确定的抽屉中。该步骤必须迅速(<2min),因为冻存管会以越10℃/min的速度升温,如果温度上升超过-50℃,细胞会迅速恶化。
1.二甲基亚砜能穿透许多合成的或天然的膜,包括皮肤和橡胶手套 。因此,应谨慎处理。
2.将冻存管放入液氮时,必须使用保护性手套和面罩。
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