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试剂、试剂盒 | |
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仪器、耗材 | |
实验步骤 | 一、切割分离法 在进行组织块培养时,可采用剪切法,一般多剪切成1 mm3大小的块。 具体操作如下: 1. 无菌切取1 cm3组织一块,置入青霉素瓶或小烧杯中,左手斜持容器,右手持眼科尖剪或弯剪(剪柄较长为好)伸入容器中,反复剪切组织至1 mm3大小为止(成糊状)。 2. 用吸管吸取Hanks液把附着在剪刀上的组织小块冲下,并再补加3~5 毫升Hanks液后,用吸管反复轻轻吸吹冲打片刻,低速离心、去上清、余下组织块即可用于培养。 3. 剪刀剪切法可能对组织有一定损伤,但操作比较方便。 亦可用手术刀反复切割法,把组织块放在凹窝玻璃中,两手各持尖手术刀一把,交错反复切害割至1 mm3为止。手术刀切割法对组织损伤较小,但在空气中暴露时间较长,污染机会大些。 以上两方法都适用于组织块培养法。 二、机械分散法 某些软组织如脑、胚胎以及一些肿瘤组织等,可采用机械法进行分散。 常用者有两种,一是把组织放入注射器针管中压挤法,二是把组织置于不锈钢纱网中用钝物压取法。 不论用那一种方法,都应把组织块先剪成小块后再处理。 其中以压取法较多用,其程序如下: 1. 清洗
取得组织后,先用BSS洗去表面血污,然后预切成5~10 mm3的小块,置入不锈钢网筛中(1 mm 孔径); 2. 压挤 把网筛放在大碟皿上方,一手持网筛柄,另手用无菌度管末端径轻压挤组织,使之穿过纱网,然后用吸管吸取营养液把纱网上剩余组织吹洗掉; 3. 反复 用吸管从碟皿中吸出较大组织块,置入10 μm 筛中,进行再压挤,方法同2; 4. 镜检 被滤过的悬液即可用于培养;可先吸取不许悬液镜检,如组织块过大,可再用20 μm 筛做进一步压挤,以分散成单个细胞或细胞团; 5. 培养 计数细胞后,接种培养。 |
注意事项 | 1. 机械纱网压挤滤过法简便易行,节省时间,但对组织可能有一定损伤。 2. 纱网网眼愈小,所需压力越大,组织受损越重,故本法仅适用于处理软组织,对较硬组织和纤维性组织效果不好。 |
实验方法原理 | 胰蛋白酶适于消化细胞间质较小的软组织,如胚胎组织、羊膜、上皮组织、肝、肾等软组织,对传代细胞也非常好。 用于消化纤维性组织或较硬的癌组织则较差。Ca2+和Mg2+对胰蛋白酶的活性有一定抑制作用,故需用不含这些离子的BSS 配制。 血清有抑制胰蛋白酶活性的作用,因此在做细胞传代时,用胰蛋白酶消化细胞后,可不必再用Hanks 液冲洗,直接加入含有血清的培养液进行培养即可。 残留的微量胰蛋白酶即被血清抑活,对细胞没有什么影响。 |
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实验材料 | |
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实验步骤 | 使用胰蛋白酶消化细胞法如下:
1. 剪切 把组织剪切成3~5 立方毫米的小块; 2. 加液 把组织置入三角烧瓶中(瓶内有铁蕊的搅棒或玻璃小球),注入比组织量多30~50 倍的0.25%的胰蛋白酶(预加温至37 ℃); 3. 消化 置电磁搅拌器台上,消化30~60 分钟,或置于37 ℃水浴中,或放于37 ℃温箱中;在两种情况下,每隔5~10 分钟摇动一次。如需长时间消化时,中间可更换一次消化液,然后静置三角烧瓶,过10 分钟,待组织下沉后,吸除2/3上清液,余1/3,再补加新胰蛋白酶液,继续消化; 4. 消化完毕,倒入离心管中,800 转/分,离心6~8 分钟后吸除上清液; 5. 用Hanks液漂洗2~3 分钟,离心去上清,共两次; 6. 800 转/分,离心5 分钟后去上清,加入一定量的营养液,通过100 微米/网眼的尼龙网或不锈钢纱网滤过,以除掉未充分消化的较大块的组织;如消化彻底可不过滤。用吸管吸取一滴细胞悬液滴于载物片上观察,如细胞分散良好、形态完整、即可用于培养。滤过时用3~4 层无菌纱布亦可。 |
注意事项 | 1. 在37 ℃温度下用胰蛋白酶长时间(1 小时以上)消化纤维性组织时,组织块表层细胞可随时从纤维网架中脱落下来。 2. 因此每隔20~30 分钟,需用不锈钢网(20~50 微米)滤过一次,离心,收集这些细胞,以免它们被消化过度受破坏。 3. 如系冷消化,在从4 ℃中取出后,亦应先滤过一次,离心,除上清,收集已游离下来的细胞;再向消化容器中寂足新胰蛋白酶液,并再重置入37 ℃温箱中,继续温消化剩余组织20~30 分钟,这样可能效果更好。 |
实验方法原理 | 胶原酶是一种由细菌中提取出的酶,对胶原有很强的消化作用,适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织等。 上皮细胞本身对胶原酶有一定耐性,但胶原酶对细胞间质有好的消化作用,可使上皮细胞与胶原成分脱离而不受伤害,效果甚好。 此酶在钙和镁离子存在情况下仍有活性,故可用BSS和含有血清的培养液配制。 |
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实验材料 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1. 把漂洗干净的组织剪切成1—5 mm3 块,向每一培养瓶中置入若干块;
2. 向每瓶中加入4.5 ml培养液,再注入5 ml粗胶原酶,使最终浓度为200 U/ml,pH6.5; 3. 置36.5 ℃中4~48 小时;如消化缓慢可延长到3~5 天,期间无需摇动;可换液1 次(仍含有胶原酶); 4. 检查消化效应可用轻轻摇动培养瓶的方法 如见组织块已变软,散于瓶底,振荡后即散成细胞团和单个细胞,此时可轻轻倒出培养液,瓶内可能有很多巨噬细胞已附于瓶底,借此能把巨噬细胞从其它细胞中分开,可用于单独培养或不用弃之; 5. 低速离心培养液5 分钟后,去上清,重悬于BSS中,再低速离心5 分钟,去上清; 6. 加入新培养液制备成细胞悬液,可接种进行培养;胰蛋白酶和胶原酶消化时间与浓度上的差异,依消化温度而异,另外两种酶也可协同应用,浓度为:胰蛋白酶0.1 mg+胶原酶0.25 mg/ml。 经过胶原酶消化后的上皮组织,由于上皮细胞对酶有耐受性,可能有一些上皮细胞团尚未被完全消化开。成小团的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更易生长,因此不必要再做进一步消化处理。胶原酶与胰蛋白酶并用时,尚可外加透明质酸酶。透明质酸酶对细胞表面糖基有作用。胶原酶与胰蛋白酶两者结合使用,对分散大鼠和兔肝等组织非常有效。
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实验方法原理 | 如培养物为血液、羊水、腹水和胸水等细胞悬液时,可采用离心法分离。一般用低速500~1000 转/分速度,离心5~10 分钟即可。如悬液量大,离心时间可适当延长,但如离心速度过大和时间太长,易压挤细胞使之受损或死亡。微量全血法淋巴细胞培养时,可不必进行淋巴细胞分离,可采用全血培养法。在需用大量白细胞进行培养情况下,才应采用特殊分离技术如使用分层液等方法。 |
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实验材料 | |
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实验步骤 | 国产淋巴细胞分层液(Lyphocyte Separation Medium)效果很好。分层液是根据细胞比重不同,使各类细胞相互分开的。红细胞比重1.092,淋巴细胞和大单核等白细胞比重为1.070;分层液适用于分离血中淋巴细胞。
1. 取抗凝血若干毫升; 2. 按1:1 加入无菌分层液(滤过除菌)后,800—1000 转离心; 3. 无菌分离出白细胞(白细胞位于红细胞上层,呈微白色); 4. BSS 漂洗1—2 次,可用于培养或其它实验。 |
注意事项 | 1. 如用动物皿(如小鼠),白细胞的比重与人不同;小鼠白细胞比重为1.080左右,需用相应比重的分层液。 |
实验方法原理 | EDTA是一种非酶性消化物,常用不含Ca2+和Mg2+的BSS 配成0.02%的工作液。 关于EDTA的作用机制一般认为是:一些组织,尤其是上皮组织,在生存中需要Ca2+和Mg2+才能维持组织的完整性。EDTA能从这些组织生存环境中吸收这些离子,形成螯合物,能促进细胞相互分离。 EDTA 作用比胰蛋白酶缓和,很少用于单独消化新鲜组织(传代细胞可单用),如与胰蛋白酶按不同比例相混合并用,消化作用更好。EDTA 最适消化传代细胞,也多与胰蛋白酶混合使用(1:1 或2:1)。 |
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实验材料 | |
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实验步骤 | 用ETDA 和胰蛋白酶混合消化法传代的过程如下 1. 吸出培养瓶内营养液,注入EDTA(0.02%)和胰蛋白酶(0.25%)混合液(1:1),注入量以能覆盖细胞为度,置37 ℃温箱或室温中作用3 分~5 分钟。
在消化过程中,要在镜下随时监视细胞状态,当见到细胞胞质回缩,胞体趋于变圆,细胞相互间缝隙变大时,便立即终止消化。 细胞上述变化在已连接成片的细胞最为明显;可见细胞由于胞质回缩,而相互分离,遂失去原来紧密接触关系,出现明显可见的缝隙。如消化过度则细胞能完全从瓶壁脱落,这时需要做离心分离以防细胞丢失,增加了麻烦; 2. 吸出消化液,注入适量Hanks液洗一二次;注意注入时要缓慢,不要让液体直接冲刷细胞多的部位,朝向瓶底或瓶角部为好,以避免把细胞从瓶壁上冲下来,然后手持培养瓶轻轻晃动,让Hanks液体在细胞面上来回流动,以洗掉残余的消化液,不要用力过猛,否则能把附着不牢的细胞冲掉,减少细胞数量; 3. 吸出Hanks液,加入适量培养液后,用吸管吸、吹营养液,反复轻轻吹打瓶壁上细胞,使之脱落入培养液中形成细胞悬液。 |
注意事项 | 1. 使用EDTA处理细胞后,因血清对其无中和作用,一定要用Hanks液产中洗液,因残留在培养液中的EDTA对细胞能产生不良作用。 |
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