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流式细胞仪检测细胞凋亡实验

标签: 流式细胞仪 细胞凋亡 染色法

流式细胞仪检测细胞凋亡可应用于:(1)鉴定细胞凋亡形态;(2)准确的进行凋亡细胞的计数;(3)进行特异的定性分析和定量分析。

详细
实验方法
  • PI单染色法
  • Heochst 33342/PI双染色法
  • Annexin V/PI双染色法
实验方法原理
主要根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变,包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等进行检测。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
一、收集细胞

收集细胞{数目约(1~ 5)x106个/mL},500~ 1 000 r/min离心5 min,弃去培养液。
 
二、细胞洗涤

3 ml PBS洗涤1次。
 
三、乙醇固定

离心去PBS,加入冰预冷的70%的乙醇固定,4℃,1-2小时。
 
四、细胞重悬

离心弃去固定液,3 mlPBS重悬5 min。
 
五、细胞过滤

400目的筛网过滤1次,500-1000 r/min离心5 min,弃去PBS。
 
六、染色

用1 ml PI染液染色,4℃避光30 min。
 
七、流式细胞仪检测

PI用氩离子激发荧光,激光光波波长为488 nm,发射光波波长大于630 nm,产生红色荧光分析PI荧光强度的直方图也可分析前散射光对侧散射光的散点图。
 
八、结果判断

在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上,凋亡细胞与正常细胞相比,前散射光降低,而侧散射光可高可低,与细胞的类型有关;在分析PI荧光的直方图时,先用门技术排除成双或聚集的细胞以及发微弱荧光的细胞碎片,在PI荧光的直方图上,凋亡细胞在G1/G0期前出现一亚二倍体峰。如以G1/G0期所在位置的荧光强度为1.0,则一个典型的凋亡细胞样本其亚二倍体峰的荧光强度为0.45,可用鸡和鲑鱼的红细胞的PI荧光强度做参照标准,两者分别为0.35和0.7,可以确保在两者之间的不是细胞碎片而是完整的细胞。
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注意事项
 细胞凋亡时,其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一,但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低,或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应该注意。
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其他
1.由于凋亡细胞核的改变,造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。研究表明,用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色,其DNA可染性降低。许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。


2.凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上,前散射光与细胞的大小有关,而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用,与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时,细胞固缩,体积变小,故前散射光降低,这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞凋亡时由于染色体降解,核破裂形成,细胞内颗粒往往增多,故凋亡细胞侧散射光常增加。细胞坏死时,由于细胞肿胀,其前散射光增大;侧散射光在细胞坏死时也增大,因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。但需要注意的是,根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。因此在某些淋巴细胞凋亡中,用光散射特性检测凋亡的可靠性较好,而在肿瘤细胞凋亡中,其可靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来,用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。也可用于活细胞的分类。

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实验方法原理

流式细胞仪通常根据细胞膜完整性将细胞分为“活细胞”和“死细胞”,因此正常细胞和凋亡细胞归为活细胞。活细胞染料如Hoechst 33342能少许进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高,Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度增高的机制与凋亡细胞膜通透性发生改变有关,凋亡细胞早期细胞膜的完整性没有明显性改变,但细胞膜的通透性已有增强,因此进入凋亡细胞中的Hoechst 33342比正常细胞的多。


此外,还与凋亡细胞的染色体DNA的结构发生了改变从而使该染料能更有效地与DNA结合以及凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst 33342排出到细胞外使之在细胞内积累增加等有关。既然Hoechst 33342进入凋亡细胞中比正常细胞更容易,而EB、PI或7-AAD等染料是不能进入细胞膜完整的活细胞中,即正常细胞和凋亡细胞在不经固定的情况下对这些染料是拒染,坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损,可被这些染料染色。


根据这些特性,用Hoechst 33342结合PI或EB等染料对凋亡细胞进行双染色,就可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。在双变量流式细胞仪的散点图上,这三群细胞表现分别为:正常细胞为低蓝色/低红色(Hoechst 33342+/PI+),凋亡细胞为高蓝色/低红色(Hoechst 33342++/PI+),坏死细胞为低蓝色/高红色(Hoechst 33342+/PI++)。


实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
一、细胞培

悬浮生长的细胞在培养的状态下加入Heochst 33342 ,终浓度为1 ug/ml; 37℃孵育7-10 min。
 
二、细胞收集

低温500 ~ 1 000 r/min离心5min弃去染液。
 
三、染色

加入1.0 ml PI染液,4℃避光染色15 min。
 
四、过滤

400目的筛网过滤1次。
 
五、流式细胞仪分析

Heochst 33342用氪激光激发的紫外线荧光,激发光波波长为352 nm,发射光波波长为400 ~ 500 nm,产生兰色荧光;PI用氩离子激光激发荧光,激发光波波长为488 nm,发射光波波长大于630 nm,产生红色荧光。分析兰色荧光对红色荧光的散点图或地形图。
 
六、结果判断

在兰色荧光对红色荧光的散点图上,结果为:正常细胞为低蓝光/低红光,凋亡细胞为高蓝光/低红光,坏死细胞为低蓝光/高红光。
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注意事项
1.  在红色荧光对兰色荧光散点图上,还可见到细胞凋亡区向细胞坏死区迁移的轨迹,可能是凋亡细胞的DNA进一步降解的缘故。
 
2.  用Heochst 33342染料与细胞孵育的时间不宜过长,一般控制在20 min之内为宜。如果太长可引起Heochst 33342的发射光谱由蓝光向红光的迁移,导致红色荧光与兰色荧光的比例改变,从而影响结果的判断。
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其他

1.  在红色荧光对兰色荧光散点图上,还可见到细胞凋亡区向细胞坏死区迁移的轨迹,可能是凋亡细胞的DNA进一步降解的缘故。

 

2.  用Heochst 33342染料与细胞孵育的时间不宜过长,一般控制在20 min之内为宜。如果太长可引起Heochst 33342的发射光谱由蓝光向红光的迁移,导致红色荧光与兰色荧光的比例改变,从而影响结果的判断。

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实验方法原理 细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面,目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外,使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂,正常主要存在于细胞膜的内面,在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V是一种Ca依赖的磷脂结合蛋白,最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白,Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性。对PS有高度的亲和性。因此,该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的,也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的,而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此,可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
一、.细胞收集

1.  悬浮细胞直接收集到10 ml的离心管中,每样本细胞数为(1~5)x106/ml。

2.  500~1 000 r/min离心5 min,弃去培养液。
 
二、细胞洗涤

1.  用孵育缓冲液洗涤1次。

2.  500~1000r/min离心5min。
 
三、细胞标记

1.  用100 ul的标记溶液重悬细胞。

2.  室温下避光孵育10~15min。
 
3.  500~1 000 r/min离心5 min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。
 
4.  加入荧光(SA-FLOUS)溶液4℃下孵育20 min,避光并不时振动。
 
四、流式细胞仪分析

流式细胞仪激发光波长用488 nm,用一波长为515 nm的通带滤器检测FITC荧光,另一波长大于560 nm的滤器检测PI。
 
五、结果判断

凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性,坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光,而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此,在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上,左下象限显示活细胞,为(FITC-/PI-);右上象限是非活细胞,即坏死细胞,为(FITC+/PI+);而右下象限为凋亡细胞,显现(FITC+/PI-)。
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