一、试剂配制
1. 培养基的配制: RPMI 1640培养基 4ml 小牛血清 1ml 青霉素和链霉素 各100U/ml PHA 0.2ml 肝素 1小滴 以5% NaHCO3调pH至7.2~7.4。4℃备用。
2. 肝素:称取0.2g溶于100ml双蒸水中,浓度为0.2%,灭菌。
3. 秋水仙素:生理盐水配制成20μg/ml浓度,灭菌,分装,置-20℃。
4. 低渗液:0.075 mol/L KCI
5. 固定液:甲醇:冰乙酸(3:1),临时配制。
6. Giemsa工作液:1份原液和9份磷酸缓冲液,临时配制。
7. 磷酸缓冲液:1/15mol/L Na2HP4、1/15 mol/L KH2PO4等体积混合。
8. 5%NaHCO3火菌滤器抽滤备用。
二、实验步骤
1. 接种,培养
(1)在无菌条件下,用灭菌注射器吸取0.2%肝素液(用生理盐水配制,灭菌)0.2ml,湿润针筒后,采静脉血1~2ml、转动注射器使血液与肝素充分混匀。
(2)无菌条件下,将肝素化血液滴入至外周血培养基内,每5ml培养液内滴入血滴28~30滴(7号针头)轻轻混匀。
(3)置37℃恒温箱内,静止培养68~72h。注意第二天观察培养液有无凝血、溶血或长菌的现象,可每天将培养液摇一摇以便细胞得到充分培养。
(4)终止培养前2~3h,加入浓度为20μg/ml的秋水仙素,每5ml培养基中用7号针头,加3~4滴使最终浓度为0.1μg/ml。轻轻摇匀后,再放入恒温箱内,继续培养2~3h,以积累较多停止在中期的分裂象。
2. 制片
(1)收获细胞:由恒温箱取出培养瓶,用吸管充分吹打培养瓶瓶壁,使细胞全部脱离瓶壁,然后将细胞液移至锥形离心管内,1500转/min,离心10min,去上清液。
(2)低渗处理:加入37℃预温的0.075mol/L KCl 8ml,反复吹打(约一百次)后,置37℃水浴箱中低渗处理25min左右。
(3)预固定:加入新鲜制备固定液1ml(甲醇:冰醋酸=3:1),轻轻混匀。
(4)离心:2000转/min,离心10min,吸弃上清液。
(5)固定:沿离心管壁慢慢加入固定液8ml,轻轻混匀,制成细胞悬液。 (6)离心:同上,吸去上清液。
(7)再固定:加固定液8ml,混匀,固定10mn。
(8)离心:同上,吸去上清液。。
(9)制细胞悬液:根据细胞量多少,加入适量固定液,充分混匀,制成细胞悬液。
(10)滴片:取出预先经冰水浸泡的载玻片,用吸管吸取混匀的细胞悬液在离冰片约30cm距离进行滴片,每片约滴2~3滴细胞悬液,使细胞较好分散。一般每一培养瓶可制3~5张标本片。
(11)染色:标本晾下后,即可用染液(Giemsa液原液1份,pH6.8的磷酸缓冲液9份)染色15min,自来水冲洗后(从背面冲洗)晾干。
3. 镜检:人类每个体细胞有46条染色体,根据染色体的长度和着丝粒位置的不同,可以分成22对常染色体和一对性染色体,男子是是46,XY;女子是46,XX。 |