1. 外周血单个核细胞的采集
(1) 用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞 80 - 100ml;
(2) 淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)。
(3) 无血清培养液洗涤 2 次,获得纯度在 90%以上的 PBMC,细胞数量需达到 1-3 x108 2. 肿瘤抗原的制备
(1) 手术切除肿瘤标本,无菌条件下,将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净;
(2) 无菌生理盐水洗 3 次;
(3) 用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎,加入 RPMI 1640 培养基,充分研磨;
(4) 200 目无菌网过滤后收集单细胞悬液;
(5)用 RPMI 1640 培养基重悬细胞至 1-2 x107/ml,装入 5ml 无菌冻存管中;
(6)将冻存管浸入液氮中速冻,10 min 后取出,再迅速放入 37℃ 水浴中解冻 10 min。反复 3-5 次;(注:也可以-80℃/37℃ 反复冻融 3-5 次。)
(7) 将肿瘤裂解物加入离心管中,3000rpm,离心 10min;
(8) 收集上清,0.22μm 滤膜过滤除菌,留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体;
(9) -80℃保存备用。
3. DC细胞的培养
(1)步骤 1 中获得的 PBMC 用无血清培养液调整细胞浓度至 2 x106/ml,置于培养瓶内;
(2)37℃,5% CO2 培养箱中孵育 2h,以使单核细胞贴壁;
(3)洗去悬浮细胞,在贴壁细胞中加入含重组人 GM-CSF(500-1,000U/ml)和重组人 IL-4(500U/ml)的无血清培养液,37℃,5%CO2培养箱中培养,诱导单核细胞向 DC 细胞分化;
(4) 每 2-3d 半量换液一次,并补足细胞因子;
(5)(可选步骤) 在培养的第 5d, 加入步骤 2 中获得的肿瘤抗原 50 μg/ml,对 DC 进行抗原负载;(注:若不对 DC 进行抗原负载,该步省略。)
(6)在培养的第 6d,加入重组人 TNF-α(10ng/ml),IL-1β(10ng/ml),IL-6(1000U/ml)和PGE2(1μg/ml),诱导 DC 细胞成熟;
(7) 在培养的第 7d 或第 8d,收获 DC 细胞,其数量应达到 1×106个以上;
(8)DC 的质检:
① 活细胞比例:台盼蓝染色验证活细胞应在 90%以上;
② 形态学观察:>90%细胞半悬浮,细胞有多个树突样突起; |