用第1 管作空白对照, 测定其余各管520 nm 的吸光度A520 。用A520 值对还原糖的umole 数作图。
为使Km 测准, 必须先加蔗糖, 精确移液, 准确计时, 每隔30 秒钟或1 分钟加酶一次, 加酶后要摇动一下试管,每支试管
都要保证准确反应5 min , 然后加1.0 ml 二硝基水杨酸试剂, 立即用保鲜膜盖住管口, 绕上橡皮筋, 用针刺一小孔, 几根试管用一根橡皮筋套住放入沸水浴, 煮5 min 后取出放入冷水中速冷。最后加3.0 ml H2O, 充分摇匀, 必要时可用一小块保鲜膜盖住管口, 反复倒转试管, 混匀。用比色杯测定时, 空白对照管溶液必须充分摇匀, 彻底除去气泡, 测A520 值时要检查参比杯内壁上是否有气泡, 若有, 须倒回原试管, 再摇动除去残余气泡。实验中不允许用嘴吸试剂。实验完毕后要注意洗手。
3. 第9、10 二管先加中止反应的NaOH 溶液, 后加酶, 以保证加酶后不再产生任何还原糖, 用以校正蔗糖试剂本身的水解和酸水解。用第9、第10 二管的数据画一直线, 求出其他各管的校正数据, 对所测各管的A520 值进行校正, 然后计算每管的[ S ] , 1/ [ S] , V 和1/ V。
4. 画出反应速度V 与底物浓度[ S ] 的关系图(米氏曲线)和1/ V-1/ [ S ] 双倒数关系图(不要直接用A520 值作图) , 计算
Km 和Vmax , 并与文献值进行比较。实验结果记录时, 要将[ S ] 和V 的单位表示清楚, 并列出反应速度的计算公式。