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标签: HL-60细胞凋亡观察
本实验目的是掌握基因组DNA提取方法,掌握凋亡细胞DNA琼脂糖凝胶电泳的原理、过程和染色方法,熟悉DNA经琼脂糖凝胶电泳后的带形,了解凋亡细胞的形态及生化特征,熟悉Hoechst33258及Giemsa染色方法以及熟悉荧光显微镜下凋亡细胞的形态变化。内容来源:中国医科大学实验指导手册。
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实验方法原理 |
放线菌素D(actinomycin D)是抗肿瘤类抗生素,其主要作用是通过与DNA 结合,阻断依赖DNA 的mRNA 的合成,从而阻碍蛋白质合成,抑制瘤细胞分裂,引起细胞凋亡。细胞凋亡时,其核染色质的DNA 出现缺口甚至断裂,致使染色质凝聚、边缘化甚至呈现DNA 碎片。利用与DNA 结合的荧光染料染色后,在荧光显微镜下即可观察到上述变化。Hoechst33258 为与A-T 结合的特异性DNA 染料,对活细胞和固定细胞均能染色。
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
一、细胞基因组DNA 提取
1. 药物处理:取处于对数生长期的HL-60 细胞(5×105 个/ml)加入放线菌素D 至终浓度5 ug/ml,37 ℃孵育20 小时。
2. 收集细胞:4 ℃,1500×g,离心5min,弃上清。
3. 清洗细胞:加入600 ulPBS 重悬细胞,1500×g,离心5 min,弃上清。
4. 加入600 ul Nuclei lysis solution,来回吸打数次。
5. 加入3 ul RNAase solution,颠倒离心管5 次,混合样品。
6. 37 ℃,水浴30 min,室温静置5 min。
7. 加入200 ul protein precipitation solution,涡振20 sec,置冰中5 min。
8. 4 ℃,13000×g 离心5min。小心吸上清于另一离心管中。
9. 向上清液中加入600 ul 异丙醇,颠倒混合。4 ℃,13000×g,离心5 min。弃上清,收集沉淀DNA。
10. 加入600 ul 70%乙醇,颠倒数次,清洗DNA。4 ℃,13000×g,离心2 min。小心弃上清,室温干燥沉淀10-15 min。
11. 加入10 ul DNA rehydration solution,65 ℃,水浴30-60 min,并定期轻柔振荡离心管使沉淀溶解。
12. 溶解液(即DNA 提取样品)4 ℃保存备用。
二、琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡 1. 灌制琼脂糖凝胶
(1)备好注胶槽,插上梳子。称1 g 琼脂糖,加100 ml TAE,微波炉加热溶解。
(2)向胶槽中注入温热的1%琼脂糖胶,胶层厚度约3-5 mm。
(3)室温静置30-45 min,使琼脂糖胶完全凝结。小心拔出梳子,将凝胶放入电泳槽,使梳孔端靠近阴极(黑色)。
(4)向电泳槽中加入TAE,让液面刚好没过凝胶约1 mm。
2. 加样,电泳 (1)在蜡膜上分别加3滴6×loading buffer,每滴2 ul。
(2)从4 ℃冰箱中取出制备好的未经放线菌素D 和经放线菌素D 处理的DNA 样品各10 ul,加入到loading buffer 中。在余下的一滴loading buffer 中加5 ul DNA marker 和5ul 灭菌去离子水,反复吸打,充分混合。
(3)用加样器分别把上述样品缓慢加至琼脂糖凝胶的加样孔中。
(4)盖上电泳槽盖,接好电极插头,打开电源,电压调至100-110 V,电泳45-60 min。
(5)将电压调至零,关电源,拔出电极插头,打开电泳槽盖。
3. 染色观察
(1)取出凝胶,放入含有EB(0.5 ug/ml)的溶液中,室温浸染20 min。
(2)于暗室中,在紫外灯下进行观察。
(3)染色结果:经放线菌素D 处理的细胞在琼脂糖凝胶电泳上呈现阶梯状DNA 区带图谱(DNA ladder),这是细胞凋亡的重要生化特征。而未经处理的细胞则没有DNA 凋亡所特有的梯形条带。DNA 断裂情况可与对照比较,断裂程度用DNAmarker 所显条带度量。
三、凋亡细胞普通光镜下形态观察――Giemsa 染色法 1. 收集凋亡细胞悬液于1.5 ml 离心管中,4 ℃,500 rpm,离心5 min。
2. 弃上清,将细胞重悬于PBS 液中,制成细胞悬液。
3. 取100 ml 细胞悬液,涂于载玻片上,晾干。
4. 用甲醇固定1 min,充分晾干。
5. 滴加Giemsa 染液(工作液浓度),室温染色5 min。
6. 用流水轻轻洗去染液,室温晾干。
7. 用二甲苯浸泡3 min,去除杂质,待载片透明后,以树脂封片。
8. 普通纤维镜下观察。
9. 结果观察:Giemsa 染色的标本,细胞核红紫色,细胞质蓝色,凋亡细胞的核染色质固缩边集,染色较深或核破裂;细胞膜皱褶、卷曲,或出泡芽生,形成凋亡小体。
四、凋亡细胞的荧光显微镜下形态观察 1. 培养细胞,诱导凋亡(在超净台进行)。
2. 收集细胞:1000 g/min 离心5 min,其上清。
3. PBS(37 ℃)漂洗悬浮细胞。
4. 固定液(4 ℃)固定5 min,500~1000 g/min 离心5 min,弃上清。
5. 蒸馏水洗,500~1000 g/min 离心5 min,弃上清。
6. 调整细胞数至0.5~0.2×106/ml。
7. 取100 μl 细胞悬液,加入1 μl Hoechst 33258 染液,染色10 min。
8. 将10 μl 染色的悬浮细胞涂于载玻片,加盖玻片。
9. 放于荧光显微镜下观察。选用UV 激发滤片和400-500 nm 阻断滤片。
10. 结果观察:细胞核呈蓝色。凋亡细胞的核染色质凝聚且边缘化,或玻
珠化,并可呈现DNA 荧光碎片。
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注意事项 |
1. 对大片段DNA 不能振荡,应轻轻反复翻动离心管,以免机械剪切力损伤DNA 链。
2. 收集沉淀DNA(特别是凋亡细胞的DNA)时需格外小心;
3. 样品加入样孔的位置应该合适;
4. 溴化乙锭为较强的致突变剂,应带乳胶手套操作;
5. 紫外光能损伤眼睛,不要直视光源;
6. 污染物须放入专用容器内,妥善处理。
7. Hoechst33258 染液应4 ℃避光保存。
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实验方法原理 |
从琼脂糖凝胶电泳中回收纯化DNA 片段的试剂盒。试剂盒采用了独特的凝胶融解系统, 结合DNA 制备膜技术, 具有高效快速的特点。本试剂盒纯化DNA 片段纯度高,完整性好。可直接用于连接反应, PCR 扩增。
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
实验步骤 |
1. 将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下,并放入2.0 ml离心管中。
2. 按1:3的比例(凝胶质量毫克数:融胶液体积微升数)加入Extraction Buffer。(每次加入的ExtractionBuffer最大体积不宜超过1.2 ml)。例如:100 mg凝胶应加入300 μl ExtractionBuffer。
3. 于恒温水浴或金属浴中55 ℃孵育,直到凝胶融化。低熔点凝胶可于50 ℃孵育,一般孵育时间不多于10分钟,孵育过程中每隔2-3分钟混匀一次。
4. 可选:按1:1的比例(凝胶质量毫克数:异丙醇体积微升数)加入异丙醇,并混合均匀。一般大于120 bp DNA片段,不需要加异丙醇。
5. 将混合液全部转移到Spincolumn内,于6,000 g离心1分钟,并弃去接液管内液体。如混合液体积大于750 μl可先转移750 μl,其余的液体待离心弃液后,再转移。
6. 向Spincolumn内加500μlExtractionBuffer,于12,000 g离心30-60秒,并弃去接液管内液体。
7. 向Spincolumn内加650 μl WashBuffer,于12,000 g离心30-60秒,并弃去接液管内液体。
8. 重复第7步一次。
9. 再次于12,000 rpm离心1分钟,然后将Spincolumn转移到无菌的1.5 ml离心管中。如不进行该步离心,则无法保证离心柱内残液被彻底清除。
10. 向Spincolumn内加50μlElutionBuffer、去离子水或TE溶液,并于室温静置1分钟。可根据实验的实际需要决定Elution Buffer用量。
11. 于12,000 g离心1分钟,1.5 ml离心管内溶液中含有目的DNA片段。
12. 回收的DNA可直接用于各类下游分子生物学实验,如果不立即使用,请保存于-20 ℃。
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注意事项 |
1. 使用前按瓶身标签标明体积加入无水乙醇,并将其混匀。
2. 结合液用好后立即盖好盖子。
3. 本试剂盒最适洗脱液体积为50 μl,洗脱液用量可根据客户实验具体情况灵活调整。
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实验方法原理 |
从琼脂糖凝胶电泳中回收纯化DNA 片段的试剂盒。试剂盒采用了独特的凝胶融解系统, 结合DNA 制备膜技术, 具有高效快速的特点。本试剂盒纯化DNA 片段纯度高,完整性好。可直接用于连接反应, PCR 扩增。
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
实验步骤 |
1. 将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下,并放入2.0 ml离心管中。
2. 按1:3的比例(凝胶质量毫克数:融胶液体积微升数)加入Extraction Buffer。(每次加入的ExtractionBuffer最大体积不宜超过1.2 ml)。例如:100 mg凝胶应加入300 μl ExtractionBuffer。
3. 于恒温水浴或金属浴中55 ℃孵育,直到凝胶融化。低熔点凝胶可于50 ℃孵育,一般孵育时间不多于10分钟,孵育过程中每隔2-3分钟混匀一次。
4. 可选:按1:1的比例(凝胶质量毫克数:异丙醇体积微升数)加入异丙醇,并混合均匀。一般大于120 bp DNA片段,不需要加异丙醇。
5. 将混合液全部转移到Spincolumn内,于6,000 g离心1分钟,并弃去接液管内液体。如混合液体积大于750 μl可先转移750 μl,其余的液体待离心弃液后,再转移。
6. 向Spincolumn内加500μlExtractionBuffer,于12,000 g离心30-60秒,并弃去接液管内液体。
7. 向Spincolumn内加650 μl WashBuffer,于12,000 g离心30-60秒,并弃去接液管内液体。
8. 重复第7步一次。
9. 再次于12,000 rpm离心1分钟,然后将Spincolumn转移到无菌的1.5 ml离心管中。如不进行该步离心,则无法保证离心柱内残液被彻底清除。
10. 向Spincolumn内加50μlElutionBuffer、去离子水或TE溶液,并于室温静置1分钟。可根据实验的实际需要决定Elution Buffer用量。
11. 于12,000 g离心1分钟,1.5 ml离心管内溶液中含有目的DNA片段。
12. 回收的DNA可直接用于各类下游分子生物学实验,如果不立即使用,请保存于-20 ℃。
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注意事项 |
1. 使用前按瓶身标签标明体积加入无水乙醇,并将其混匀。
2. 结合液用好后立即盖好盖子。
3. 本试剂盒最适洗脱液体积为50 μl,洗脱液用量可根据客户实验具体情况灵活调整。
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