临床样本分析
探究脓毒症患者血浆HDCA水平的变化及其与疾病严重程度的关系。
招募13对脓毒症患者和健康对照，通过LC-MS/MS检测血浆HDCA浓度，并分析其与SOFA评分、APACHE II评分及动脉血乳酸水平的相关性。
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肠道微生物代谢物猪去氧胆酸靶向TLR4/MD2复合物以减轻炎症并保护免受脓毒症
Gut microbial metabolite hyodeoxycholic acid targets the TLR4/MD2 complex to attenuate inflammation and protect against sepsis
实验完整度
高包括临床样本（血浆HDCA水平与疾病严重度相关性）、小鼠CLP模型（生存率、器官损伤评估）、细胞实验（巨噬细胞炎症及TLR4信号通路）、分子机制（SPR结合、免疫共沉淀、分子对接）和TLR4基因敲除验证等至少三个独立证据层级，并包含功能验证和机制验证。
主要模型
CLP诱导的脓毒症小鼠模型 LPS诱导的内毒素血症小鼠模型 骨髓来源巨噬细胞（BMDMs） THP-1分化巨噬细胞（THP-1-dMs） 脓毒症患者队列
重点核对
HDCA给药剂量：20 mg/kg，口服灌胃，于CLP术前2小时给予 小鼠品系：C57BL/6J野生型及TLR4基因敲除小鼠，6-8周龄，雄性 体外LPS刺激浓度：BMDMs使用100 ng/mL，THP-1-dMs使用500 ng/mL 体外HDCA处理浓度：BMDMs使用10 μM或20 μM，THP-1-dMs使用20 μM 免疫共沉淀检测HDCA对TLR4/MD2二聚化的影响
摘要
脓毒症是一种由严重微生物感染引发的全身性炎症反应所致的危重病症，构成了全球公共卫生挑战。然而，目前仍缺乏有效的治疗或干预措施来预防和对抗脓毒症。在此，我们报道猪去氧胆酸（HDCA）在脓毒症中具有优异的抗炎特性。我们发现脓毒症患者的血浆HDCA浓度显著降低，并与疾病严重程度呈负相关。在脓毒症小鼠模型中，血浆和盲肠内容物中的HDCA水平也观察到类似变化，并且这些变化与产生HDCA的菌株丰度降低相关。有趣的是，给予HDCA可显著降低全身炎症反应、预防器官损伤并延长脓毒症小鼠的生存期。我们证明HDCA通过竞争性阻断脂多糖与Toll样受体4（TLR4）和髓样分化因子2受体复合物的结合，抑制炎症巨噬细胞的过度激活，这一独特机制使HDCA成为炎症信号的内源性抑制剂。此外，我们在TLR4基因敲除小鼠中验证了这些发现。我们的研究强调了HDCA作为脓毒症治疗分子的潜在价值。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肠道微生物代谢物猪去氧胆酸（HDCA）是否具有抗炎作用并保护机体免受脓毒症诱导的损伤，其潜在机制是什么？
- 核心机制
- HDCA作为内源性TLR4抑制剂，通过竞争性结合TLR4/MD2复合物，阻断LPS与受体的结合，抑制下游MAPK和NF-κB信号通路的激活，从而减少炎症因子的产生。
- 主要证据
- 临床样本显示脓毒症患者血浆HDCA水平降低且与疾病严重程度负相关；小鼠CLP模型证实HDCA治疗可降低炎症反应、减轻器官损伤并提高生存率；体外实验表明HDCA抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症反应和TLR4下游信号通路磷酸化；SPR和免疫共沉淀证明HDCA直接结合TLR4/MD2复合物并干扰其二聚化；TLR4敲除小鼠中HDCA的保护效应消失。
- 研究意义
- HDCA作为一种天然内源性TLR4抑制剂，在脓毒症小鼠模型中发挥保护作用，具有治疗脓毒症及其他涉及TLR4信号通路的炎症性疾病的潜在价值。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠脓毒症模型建立与HDCA检测
验证脓毒症小鼠模型中HDCA水平的改变，并探究其与肠道菌群的关系。
采用盲肠结扎穿刺（CLP）建立脓毒症小鼠模型，检测血浆和盲肠内容物HDCA浓度，并对盲肠内容物进行宏基因组测序分析。
HDCA对脓毒症小鼠的保护作用评估
评估HDCA治疗对脓毒症小鼠生存率、器官损伤和全身炎症的影响。
在CLP或LPS诱导的脓毒症模型中，小鼠术前2小时口服HDCA（20 mg/kg），记录72小时生存率，评估肺组织损伤、炎症细胞浸润、细胞因子水平和器官功能指标。
单细胞转录组分析免疫细胞亚群
探究HDCA对脓毒症小鼠外周血单个核细胞（PBMC）中免疫细胞亚群及炎症信号通路的影响。
对脓毒症小鼠PBMC进行单细胞RNA测序，分析免疫细胞亚群，比较不同组间细胞比例和基因表达差异，并进行KEGG通路富集和GSVA分析。
体外巨噬细胞炎症反应验证
验证HDCA对LPS刺激的巨噬细胞和中性粒细胞炎症反应的抑制作用。
分离并培养BMDMs、THP-1-dMs和中性粒细胞，以不同浓度HDCA预处理后加入LPS刺激，检测炎症因子mRNA水平和细胞活性。
TLR4信号通路检测
探究HDCA对LPS诱导的TLR4下游MAPK和NF-κB信号通路的影响。
LPS刺激BMDMs和THP-1-dMs后，用Western blot检测MAPK（p38、ERK、JNK）和NF-κB（p65）的磷酸化水平。
HDCA靶点鉴定
验证HDCA是否直接靶向TLR4/MD2复合物，并确定其结合位点。
通过FITC-LPS结合实验、SPR分析、免疫共沉淀和分子对接，评估HDCA与TLR4/MD2的结合亲和力、结合位点及对LPS结合的竞争作用。
TLR4敲除小鼠验证
确认HDCA的抗炎作用依赖于TLR4信号通路。
在TLR4基因敲除小鼠中重复CLP模型和HDCA治疗，评估炎症反应和组织损伤，并与野生型小鼠对比。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
样本处理与定量分析
细胞功能分析
基因表达检测
蛋白表达与相互作用分析
单细胞与转录组分析
分子模拟
组织病理学分析
流式细胞术
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 液相色谱-串联质谱定量 | TSQ Vantage 三重四极杆质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Hypersil Gold C18色谱柱 | -- | -- | |
| Prelude SPLC系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| TraceFinder软件（版本3.3 sp1） | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 宏基因组测序 | BGISEQ-500平台 | BGI | -- |
| 单细胞RNA测序 | GemCode单细胞平台 | 10x Genomics | -- |
| 转录组测序 | Illumina Novaseq 6000平台 | Illumina | -- |
| 流式细胞术 | FACSCalibur流式细胞仪 | BD Bioscience | -- |
| FlowJo软件（v.10） | Tree Star | -- | |
| SPR实验 | PlexArray HT系统 | Plexera Bioscience | -- |
| Origin 9.0 | OriginLab | -- | |
| BIAevaluation 4.1.1 | -- | -- | |
| 免疫沉淀 | Pierce经典免疫沉淀试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 26146 |
| 无内毒素质粒提取试剂盒 | Omega | D6950-01B | |
| 分子对接 | Schrodinger-Maestro（版本11.1） | Schrodinger | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism 9 | GraphPad Software | -- |
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | -- | -- |
| 1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清（FBS） | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | R&D Systems | 416-ML-050 | |
| 佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA） | Selleck | S7791 | |
| THP-1细胞（ATCC TIB-202） | ATCC | -- | |
| 单细胞RNA测序 | PBMC分离试剂盒 | Solarbio | P6340 |
| 流式细胞术 | FITC标记的脂多糖 | Sigma | F8666 |
| euro-405-CD11b抗体 | eBioscience | 48-0112-82 | |
| PE-F4/80抗体 | eBioscience | 12-4801-82 | |
| 细胞染色缓冲液 | BD | 420201 | |
| SPR实验 | 重组人TLR4蛋白 | Sino Biological | 10146-H08B |
| 重组人MD2蛋白 | Sino Biological | MB16MY1221 | |
| 重组人TLR4 D294A突变蛋白 | Sino Biological | MF16JU2051 | |
| 重组人TLR4 K362A突变蛋白 | Sino Biological | MF16JU1442 | |
| 重组人MD2 S120A突变蛋白 | Sino Biological | MB16MY2092 | |
| TLR4/MD2复合物重组蛋白 | R&D Systems | 3146-TM-050 | |
| 免疫沉淀 | HA抗体 | Proteintech | 51064-2-AP |
| 动物实验 | 猪去氧胆酸 | Aladdin | -- |
| 万古霉素 | -- | -- | |
| 硫酸新霉素 | -- | -- | |
| 甲硝唑 | -- | -- | |
| 迟缓真杆菌ATCC 8486 | ATCC | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| HDCA定量检测 | 样本处理：血浆和盲肠内容物样本的采集和预处理方法；LC-MS/MS参数：色谱柱型号、流动相组成、质谱条件。 阅读提示：参考Materials and methods中的“Quantitative analysis of HDCA” |
| 脓毒症小鼠模型建立 | 小鼠品系、年龄、性别；CLP手术具体步骤：穿刺针规格、结扎位置、挤出盲肠内容物量；术后补液量；观察时间点。 阅读提示：参考Materials and methods中的“Experimental animals” |
| HDCA治疗 | HDCA剂量：20 mg/kg；给药途径：口服灌胃；给药时间：CLP术前2小时；对照组溶剂：0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）。 阅读提示：参考Materials and methods中的“Experimental animals” |
| 细胞培养与刺激 | BMDMs分化条件：M-CSF浓度和天数；THP-1分化条件：PMA浓度和时间；LPS刺激浓度和处理时间；HDCA预处理浓度和时间。 阅读提示：参考Materials and methods中的“Sorting, isolation, and culture of cells”和相关图注 |
| 分子机制检测 | SPR实验条件：重组蛋白浓度、固定方法、HDCA浓度梯度；免疫共沉淀所用抗体和细胞裂解条件；分子对接所用软件和参数。 阅读提示：参考Materials and methods中的“SPR experiment”、“Immunoprecipitation”和“Simulations of HDCA docking with TLR4/MD2” |