微流控装置制备
构建适用于细胞培养和隐孢子虫感染的微流控平台。
使用PDMS和玻璃盖玻片制备包含3个微通道的装置，通道内涂覆Matrigel。
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一种无泵无管的微流控装置可实现小隐孢子虫的延长体外发育
A Pumpless and Tubeless Microfluidic Device Enables Extended In Vitro Development of Cryptosporidium parvum
实验完整度
高包含微流控培养、免疫荧光、定量PCR、扫描电镜等多层级验证，并进行了卵囊感染性传代实验。
主要模型
HCT-8细胞系 微流控芯片培养模型 C. parvum Iowa-IIaA17G2R1卵囊
重点核对
微流控装置中流体剪切应力为0.02 dyn cm−2 HCT-8细胞接种密度为每通道2 × 10^5个细胞 感染使用1 × 10^4个脱囊卵囊或4 × 10^5个纯化子孢子 感染后每48小时进行取样检测，持续10天 感染培养基每天更换
摘要
背景：肠道寄生虫隐孢子虫因对氯消毒具有抗性，仍然是全球饮用水处理面临的挑战。然而，缺乏一种兼具成本效益和可靠性的隐孢子虫体外培养系统，仍是隐孢子虫研究的关键瓶颈。方法：本文报道了在流体剪切应力下，微流控培养人回盲肠结直肠腺癌（HCT-8）细胞能够实现小隐孢子虫的延长发育。具体而言，使用免疫荧光检测、扫描电子显微镜和定量聚合酶链反应评估了小隐孢子虫在用户友好的无泵微流控装置中的生长，结果显示其发育总共持续了10天。结果：在微流控装置内产生的卵囊能够感染新鲜的HCT-8单层细胞；然而，这些卵囊仅以低水平存在。结论：我们预期这种微流控方法将促进隐孢子虫的广泛体外研究，并有可能进一步开发为水行业的常规感染性评估工具。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 开发一种成本效益高且可靠的隐孢子虫体外培养系统，以支持其完整发育。
- 核心机制
- 流体剪切应力改变了HCT-8细胞的表型，使其更接近体内生理状态，从而延长了小隐孢子虫的发育时间。
- 主要证据
- 在微流控装置中，小隐孢子虫发育持续至10天，扫描电镜观察到所有常见生命周期阶段，且产生的卵囊能感染新鲜HCT-8单层细胞。
- 研究意义
- 该微流控方法有望成为隐孢子虫研究的常规工具，并可能发展为水行业评估感染性的实用方法。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
HCT-8细胞培养
在微流控装置内建立HCT-8细胞单层，用于后续感染实验。
HCT-8细胞接种于Matrigel包被的微通道中，在流体剪切应力下培养至约90%汇合。
隐孢子虫感染
用脱囊预处理的小隐孢子虫卵囊感染HCT-8单层细胞。
将脱囊预处理的卵囊或纯化子孢子接种至HCT-8单层细胞，并维持培养。
寄生虫载量监测
定量检测感染后不同时间点的寄生虫载量。
每隔48小时收集感染培养基、线程和细胞单层，使用定量PCR和免疫荧光检测寄生虫载量。
扫描电镜观察
观察感染后寄生虫的形态和生命周期阶段。
感染后48小时固定样品，制备并观察扫描电镜图像。
新卵囊检测与感染性评估
检测微流控装置中是否产生新卵囊，并评估其感染性。
收集感染后培养基，用EasyStain抗体检测卵囊，并将培养基应用于新鲜HCT-8单层细胞以测试感染性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 微流控装置制备 | 聚二甲基硅氧烷 | -- | -- |
| 基质胶 | Corning | -- | |
| RPMI-1640培养基 | Sigma | -- | |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Bovogen | -- |
| 青霉素-链霉素 | Sigma | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Sigma | -- | |
| HEPES缓冲液 | Sigma | -- | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Sigma | -- | |
| TRITC-鬼笔环肽 | Sigma | -- | |
| Hoechst 33342染料 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 正常山羊血清 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | -- | |
| 寄生虫感染 | 牛胆汁 | Sigma | -- |
| 叶酸 | Sigma | -- | |
| 泛酸钙 | Sigma | -- | |
| L-抗坏血酸 | Sigma | -- | |
| 两性霉素B | Sigma | -- | |
| 注射器过滤器 | Whatman | -- | |
| 寄生虫检测 | Sporo-Glo抗体 | Waterborne Inc. | -- |
| EasyStain抗体 | BioPoint Pty Ltd. | -- | |
| 显微成像 | IX83倒置荧光显微镜 | Olympus | -- |
| 尼康Eclipse TS100显微镜 | Nikon | -- | |
| 尼康Eclipse 80i荧光显微镜 | Nikon | -- | |
| Zeiss Supra 55VP场发射扫描电镜 | Zeiss | -- | |
| 定量PCR | CFX96 Touch实时荧光定量PCR检测系统 | Bio-Rad | -- |
| GoTaq探针qPCR预混液 | Promega | -- | |
| gBlocks双链DNA基因片段 | Integrated DNA Technologies | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 微流控装置制备 | PDMS与玻璃键合工艺，通道尺寸（长36 mm，宽1 mm，高155 µm），Matrigel包被浓度（1% v/v）和孵育时间（60分钟） 阅读提示：参见Methods中'Fabricating Microfluidic Devices'部分 |
| HCT-8细胞培养 | HCT-8细胞接种密度（每通道2 × 10^5），培养基成分（RPMI-1640添加10% FCS等），剪切应力（0.02 dyn cm−2），培养时间（约5天至90%汇合） 阅读提示：参见Methods中'HCT-8 Cell Culture Inside the Microfluidic Device'部分 |
| 隐孢子虫感染 | 感染剂量（每通道1 × 10^4卵囊或4 × 10^5子孢子），感染培养基成分，感染前无流动孵育时间（4小时），感染后培养基更换频率（每24小时） 阅读提示：参见Methods中'Excystation Pretreatment of Oocysts, Sporozoite Purification, and Infection of HCT-8 Cells'部分 |
| 寄生虫载量检测 | 取样时间点（每48小时），定量PCR靶向基因（C型凝集素），免疫荧光抗体（Sporo-Glo），总监测时间（10天） 阅读提示：参见Methods中'Parasite Enumeration Using Immunofluorescence Assays (Sporo-Glo Ab) and Quantitative PCR'部分 |
| 扫描电镜观察 | 固定时间（感染后48小时），固定液（2.5%戊二醛），电镜参数（加速电压5 kV） 阅读提示：参见Methods中'Preparation of Microfluidic Devices for Scanning Electron Microscopy'部分 |
| 新卵囊检测与感染性评估 | 培养基收集时间（感染后1至10天），EasyStain免疫荧光检测，感染性评估方法（将感染后第3天的培养基应用于新鲜HCT-8单层细胞） 阅读提示：参见Methods中'Detection of New Oocysts Produced In Vitro'部分 |