样本收集和测序
获取多种正常和肿瘤样本的全基因组甲基化数据，以识别ASM位点。
对24个正常样本进行SureSelect甲基化测序，对81个样本（包括16个癌症）进行WGBS。
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等位基因特异性DNA甲基化在癌症中增加，其在正常和肿瘤细胞中的密集定位提高了疾病相关调控SNP的产量
Allele-specific DNA methylation is increased in cancers and its dense mapping in normal plus neoplastic cells increases the yield of disease-associated regulatory SNPs
实验完整度
高包含多种正常组织、细胞和三种癌症的WGBS和SureSelect甲基化测序，以及靶向亚硫酸盐测序验证、ChIP-seq ASB分析、体细胞突变关联分析和GWAS关联分析，多个独立证据层级。
主要模型
正常免疫细胞（T细胞、B细胞、单核细胞/巨噬细胞） 大脑皮层神经元和胶质细胞 多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤和胶质母细胞瘤 胎盘滋养层细胞 GM12878淋巴母细胞系
重点核对
WGBS和SureSelect测序的样本类型和数量 ASM DMR的定义阈值：至少3个CpG，Fisher精确检验p<0.05，甲基化差异>20% 癌症样本的配对正常样本（如骨髓瘤配对外周血B细胞） 靶向bis-seq验证的样本和位点 体细胞突变检测的样本（4例骨髓瘤）和配对正常B细胞
摘要
背景：等位基因特异性DNA甲基化（ASM）的定位可以成为后GWAS策略，用于定位调控序列多态性（rSNPs）。这种方法的优势以及正常和肿瘤细胞中ASM的机制仍有待阐明。结果：我们对多种正常细胞和组织以及三种癌症类型进行了全基因组甲基化测序。在排除印记后，数据确定了15,112个高置信度ASM差异甲基化区域，其中1,838个包含与GWAS峰强连锁不平衡或恰好重合的SNP。与匹配的正常组织相比，癌症中的ASM频率增加，这是由于广泛的等位基因特异性低甲基化和在静息染色质中的局灶性等位基因特异性高甲基化。癌细胞在ASM位点显示等位基因转换增加，但特定类别的CTCF和转录因子结合基序中的破坏性SNP在癌症和非癌症中与ASM的相关性相似。影响这些相同基序类别的罕见体细胞突变与从头ASM相关。来自ChIP-seq的等位基因特异性转录因子结合在ASM位点中富集，但大多数ASM差异甲基化区域缺乏此类注释，其中一些位于其他信息贫乏的“染色质沙漠”中。结论：ASM在癌症中增加，但通过涉及正常和肿瘤细胞中CTCF和转录因子结合位点中破坏性SNP的共同机制发生。在正常和癌症样本中的密集ASM定位揭示了通过其他方法难以发现的候选rSNP。与GWAS数据一起，这些rSNP可以提名自身免疫、心脏代谢、神经精神和肿瘤疾病易感性中的特定转录通路。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ASM在正常和肿瘤细胞中的频率和机制如何，以及密集ASM定位是否能提高与疾病相关的调控SNP的鉴定效率？
- 核心机制
- ASM由CTCF和转录因子结合基序中的破坏性SNP导致等位基因特异性结合占用差异所驱动，该机制在正常和肿瘤细胞中共享；癌症中ASM增加主要由于广泛的等位基因特异性低甲基化和局灶性等位基因特异性高甲基化。
- 主要证据
- 对81个样本进行WGBS和24个样本进行SureSelect测序，发现肿瘤中ASM频率增加5-9倍；靶向bis-seq验证率达96%；ChIP-seq显示ASB在ASM位点富集；体细胞突变与从头ASM相关且富集于相同TF基序类别。
- 研究意义
- 密集ASM定位可以揭示通过其他后GWAS方法难以发现的候选rSNP，与GWAS数据结合可提名自身免疫、心脏代谢、神经精神和肿瘤疾病易感性的转录通路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ASM DMR识别和验证
识别高置信度ASM区域，并通过交叉平台和靶向测序进行验证。
使用严格标准（至少3个CpG，Fisher精确检验p<0.05，甲基化差异>20%）调用ASM DMR，并通过SureSelect和WGBS交叉比较，以及27个DMR的靶向bis-seq验证。
癌症和正常样本的ASM比较
评估癌症中ASM频率的变化及其表观遗传特征。
比较癌症和匹配的正常样本的ASM频率，分析等位基因特异性甲基化变化（LOM和GOM）。
机制分析：TF和CTCF基序破坏
检验ASM是否与破坏性SNP在TF和CTCF结合基序中的相关性。
通过atSNP预测SNP对基序亲和力的影响，分析ASM与PWM分数差异的相关性，并利用ENCODE ChIP-seq数据验证ASB。
体细胞突变与从头ASM分析
确定体细胞突变是否可导致从头ASM，并探索其机制。
对4例骨髓瘤及其配对B细胞进行体细胞突变检测，分析突变是否与从头ASM相关，并检查是否富集于与ASM相关的TF基序类别。
GWAS关联和rSNP鉴定
评估ASM位点与GWAS峰的连锁不平衡，以确定候选rSNP。
使用Gabriel等方法定义单倍型块，计算ASM SNP与GWAS SNP的LD（R²和D'），并注释与疾病相关的ASM SNP。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| DNA测序 | Illumina HiSeq2500 | Illumina | -- |
| Illumina X系统 | Illumina | -- | |
| Illumina NovaSeq | Illumina | -- | |
| Illumina MiSeq | Illumina | -- | |
| 靶向测序 | Fluidigm AccessArray系统 | Fluidigm | -- |
| DNA测序 | Agilent SureSelect甲基化测序DNA杂交捕获试剂盒 | Agilent | -- |
| DNA亚硫酸盐转化 | EZ DNA甲基化试剂盒 | Zymo | -- |
| WGBS文库构建 | Nextera XT转座酶 | Illumina | -- |
| TruSeq DNA甲基化试剂盒 | Illumina | -- | |
| ACCEL-NGS甲基化测序DNA文库试剂盒 | Swift Biosciences | -- | |
| 细胞分离 | RosetteSep试剂盒 | Sigma | -- |
| 细胞培养 | RPMI培养基 | -- | -- |
| 细胞因子处理 | 巨噬细胞集落刺激因子 | -- | -- |
| 细胞分离 | 抗体偶联磁珠 | Miltenyi Biotec | -- |
| 细胞核分选 | 抗NeuN抗体 | -- | -- |
| 对照细胞系 | GM12878 | Coriell | -- |
| 细胞培养 | 原代膀胱上皮细胞 | A.T.C.C.或Cell Applications, Inc. | -- |
| 原代乳腺上皮细胞 | Cell Applications, Inc.或ScienCell Research Laboratories | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本类型和数量 | 正常样本和癌症样本的具体类型、数量及来源，SureSelect和WGBS的样本分配。 阅读提示：Materials and methods, Human cells and tissues; 补充表S1 |
| ASM DMR定义 | ASM DMR的判定阈值：至少3个CpG，Fisher精确检验p<0.05，绝对甲基化差异>20%，FDR<0.05，至少2个连续CpG。 阅读提示：Materials and methods, Read mapping, SNP calling, and identification of ASM DMRs |
| 测序方法 | SureSelect和WGBS的文库构建方法、测序平台、读长和覆盖度。 阅读提示：Materials and methods, Agilent SureSelect methyl-seq and WGBS |
| 体细胞突变检测 | 体细胞突变的过滤条件：dbSNP147去除、配对样本过滤、覆盖度≥10×/等位基因。 阅读提示：Materials and methods, Somatic mutation calling |
| 靶向bis-seq验证 | 靶向bis-seq的引物设计、PCR条件、测序深度≥100 reads/等位基因，以及bootstrapping方法。 阅读提示：Materials and methods, Targeted bisulfite sequencing (bis-seq) for validations of ASM |
| GWAS关联分析 | 单倍型块定义（Gabriel方法，严格和宽松参数）、LD计算（R²和D'）、GWAS数据来源。 阅读提示：Materials and methods, Associations of ASM with GWAS peaks |