从NGS数据预测非参考新抗原肽段
从RNA-Seq数据中鉴定潜在的基因融合、单氨基酸变异、插入缺失及其他非参考转录本序列，生成用于质谱搜索的定制化蛋白数据库。
使用Arriba、CustomProDB、StringTie等工具分别鉴定基因融合、SAV/InDel和非参考转录本，并与UniProt参考蛋白序列和常见污染物序列合并，生成最终数据库。
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iPepGen：一个模块化的免疫肽基因组学分析流程，用于癌症肽新抗原候选物的发现、验证和优先级排序
iPepGen: a modular, immunopeptidogenomic analysis pipeline for discovery, verification, and prioritization of cancer peptide neoantigen candidates
实验完整度
中开发并验证了模块化生物信息学流程，使用MPNST等细胞系数据进行了功能演示，但主要依赖计算分析，缺乏湿实验功能验证。
主要模型
STS-26T恶性外周神经鞘瘤细胞系 急性髓系白血病细胞系 黑色素瘤细胞系
重点核对
PepQuery2验证候选新抗原肽段，并计算p值 BLAST-P过滤与参考蛋白同源的肽段 FragPipe分析中的FDR控制（PSM和蛋白水平均为1%） HLA基因分型（OptiType和Seq2HLA） NetMHCpan_EL预测肽段与HLA等位基因的结合亲和力
摘要
表征源自基因组或转录组畸变并呈递给免疫系统的肿瘤特异性新抗原肽，对于免疫肿瘤学研究至关重要。为此，模块化的 iPepGen 免疫肽基因组学流程提供了以下功能：(1) 从基因组或转录组测序数据中预测新抗原并生成蛋白质数据库；(2) 肽段鉴定；(3) 从免疫肽组质谱数据中验证；(4) 新抗原分类与可视化；(5) 候选物优先级排序以供进一步研究。通过公开、可扩展的基于云的网关以及在线交互式培训材料的便捷访问，简化了需要免疫肽基因组学分析工具但缺乏高级计算专业知识和资源的癌症研究人员的采用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 开发并验证一个模块化的、基于Galaxy的免疫肽基因组学分析流程，以支持癌症新抗原肽段的发现、验证和优先级排序。
- 核心机制
- 该流程整合了从NGS数据预测非参考序列、使用无酶特异性数据库搜索进行免疫肽组MS/MS数据分析、通过PepQuery2进行肽段中心验证、基因组分类和HLA结合预测，以鉴定和优先排序新抗原候选物。
- 主要证据
- 在MPNST细胞系数据和公开可用的多组学数据上，该流程成功鉴定并验证了新的非参考肽段，包括来自UTR、内含子等非经典基因组区域的肽段，并对其HLA结合亲和力进行了预测。
- 研究意义
- 该流程通过提供可访问的、可扩展的、具有培训资源的平台，降低了免疫肽基因组学分析的技术门槛，为免疫肿瘤学研究提供了有价值的工具。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
从免疫肽组MS/MS数据中鉴定候选新抗原肽段
使用FragPipe套件对LC-MS/MS数据进行无酶特异性数据库搜索，以鉴定与HLA分子结合的肽段。
使用MSFragger进行无酶搜索（肽段长度8-20氨基酸），MSBooster进行rescoring，Percolator进行验证，Philosopher进行FDR控制。
验证候选新抗原肽段
使用PepQuery2对FragPipe鉴定的非参考肽段进行二次验证，以排除假阳性。
使用PepQuery2进行肽段中心验证，考虑参考蛋白序列和常见PTM，并生成随机序列进行统计检验；随后使用BLAST-P过滤与参考蛋白同源的序列。
可视化并分类已验证的新抗原肽段
将验证的新抗原肽段映射到基因组坐标，并分类其起源（如CDS、UTR、内含子等）。
使用PepPointer工具将肽段映射至基因组并分类，提供IGV和UCSC基因组浏览器的可视化链接。
对新抗原候选物进行优先级排序
预测已验证新抗原肽段与HLA等位基因的结合亲和力和免疫原性，以优先排序候选物。
使用OptiType和Seq2HLA进行HLA基因分型，使用IEDB工具（NetMHCpan_EL）预测肽段-HLA结合，并使用pVACbind套件进行增强的免疫原性预测。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 庆大霉素 | -- | -- |
| 免疫沉淀 | W6/32单克隆抗体 | -- | -- |
| 质谱分析 | Orbitrap Eclipse质谱仪 | ThermoFisher | -- |
| 质谱数据分析 | FragPipe | -- | -- |
| PepQuery2 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞样本来源与处理 | STS-26T细胞系用于演示；真实性经STR基因分型确认，支原体检测阴性；使用gentamicin (50 µg/mL)处理以促进核糖体通读。 阅读提示：Methods: Description of materials and data |
| 免疫肽组学数据采集 | 使用W6/32抗体免疫沉淀MHC I类复合物；使用Orbitrap Eclipse质谱仪进行DDA模式分析。 阅读提示：Methods: Description of materials and data |
| 数据库搜索 | FragPipe（v23.0）用于无酶搜索（8-20个氨基酸）；数据库分成200个部分以减少内存；FDR控制在1%（PSM和蛋白水平）。 阅读提示：Methods: Module 2: discovery of candidate neoantigen peptides |
| 新抗原验证 | PepQuery2用于肽段中心验证，需设置参考序列长度窗口（例如9-11个氨基酸）；BLAST-P用于排除与参考蛋白同源的序列。 阅读提示：Methods: Module 3: verification of neoantigen peptide-spectrum matches |
| 新抗原优先级排序 | HLA基因分型使用OptiType和Seq2HLA；结合预测使用IEDB工具的NetMHCpan_EL；强结合（≤0.5%）和弱结合（0.5-2%）的阈值已定义。 阅读提示：Methods: Module 5: prioritization of neoantigens via HLA binding prediction |