构建ASE分析流程
建立从snRNA-seq数据提取等位基因表达信息的计算流程。
开发了基于Nextflow的pipeline，输入FASTQ和phased VCF，利用STARsolo和WASP进行比对和偏差校正，输出基因和SNP水平的ASE信息。
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从单核RNA-seq数据中等位基因不平衡分析的实验和计算方法
Experimental and computational methods for allelic imbalance analysis from single-nucleus RNA-seq data
实验完整度
高研究包含体外细胞系（GTEx样本）和患者样本（PD队列）等多个证据层级，并进行了功能验证（ASE分析）和机制验证（eQTL对比）。
主要模型
人脑皮层组织样本（GTEx） 帕金森病患者脑组织样本（PD队列）
重点核对
测序读长（如130碱基和202碱基） 杂交捕获目标基因区域 SNP基因分型（phased VCF） 内含子与外显子区域 样本量（GTEx 2例，PD 94例）
摘要
将等位基因特异性表达（ASE）分析与单细胞RNA-seq相结合，可以阐明基因组变异如何在单细胞水平影响RNA表达。我们探讨了实验和计算选择如何影响基于ASE的方法的效能，并开发了一套单细胞ASE计算工具。利用单核RNA-seq，我们从内含子区域比外显子区域提取了更多的ASE信息。我们展示了读长如何增加效能，以及杂交捕获如何提高检测目标基因ASE的效能。我们将我们的方法应用于帕金森病队列，并表明ASE分析比eQTL分析具有更高的效能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何优化实验和计算方法，以从单核RNA-seq数据中有效地检测等位基因不平衡？
- 核心机制
- 等位基因不平衡分析通过比较个体内母源和父源等位基因的表达，来识别由SNP导致的差异调控，此机制优于eQTL分析，因为不受个体间变异影响。
- 主要证据
- 通过GTEx样本和PD队列的snRNA-seq数据，结合杂交捕获和长读测序，证明了ASE方法相比eQTL具有更高效能。
- 研究意义
- 该研究为利用ASE分析单核RNA-seq数据提供了优化方案和工具，有助于揭示基因组变异对细胞功能的影响。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
短读长参数优化
评估读长、测序深度、细胞数等参数对ASE检测效能的影响。
对GTEx样本进行不同读长（55-180bp）和测序深度处理，分析phased UMIs数量和显著不平衡基因数。
长读测序技术评估
评估不同长读测序平台（PacBio、ONT、MAS-seq）在ASE分析中的效能。
对GTEx样本的cDNA进行PacBio Sequel II、ONT GridION/PromethION和MAS-seq测序，比较phased UMIs数量。
杂交捕获目标基因
通过杂交捕获富集目标基因区域，提高特定基因的ASE检测效能。
在GTEx和PD样本中设计bait，对目标基因进行杂交捕获，测序后比较富集前后的phased UMIs。
ASE检测方法比较
比较不同统计方法（pseudobulk、mixed model、DAESC）在ASE检测中的效能和假阳性率。
在PD队列中，对94例个体的snRNA-seq数据应用不同统计模型，并评估其假阳性率，比较效能并验证结果。
ASE与eQTL分析比较
比较ASE分析与eQTL分析在检测SNP-gene关联中的效能。
利用非杂交捕获的PD数据，对SNP/gene pairs进行eQTL分析和ASE分析，通过降采样比较显著关联数量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞核分离 | 重组RNase抑制剂 | Takara | 2313A |
| EZ prep裂解缓冲液 | Sigma | NUC101 | |
| 细胞筛网 | VWR | 21008-949 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Invitrogen | AM9625 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | B6917 | |
| Cellometer K2图像细胞仪 | Nexcelom Bioscience | CMT-K2-MX-150 | |
| 细胞核分离（PD样本） | 细胞核纯化试剂盒 | Sigma | NUC201-1KT |
| 二硫苏糖醇 | Sigma | 43816 | |
| 曲拉通X-100 | Sigma | T8787 | |
| 70微米滤网 | Thermo Fisher Scientific | 2236548 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液 | Gibco | 14190-144 | |
| 牛血清白蛋白 | Thermo Fisher Scientific | AM2616 | |
| 重组RNase抑制剂 | Takara | 2313B | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| 40微米flowmi细胞筛网 | Bel-art | H13680-0040 | |
| FACSAria III细胞分选仪 | BD Biosciences | -- | |
| 流式细胞术尺寸校准试剂盒 | Invitrogen | F13838 | |
| 文库构建 | Chromium单细胞3'芯片B | 10x Genomics | 1000073 |
| Chromium单细胞3'文库与凝胶珠试剂盒v3 | 10x Genomics | 1000075 | |
| 测序 | NextSeq 500 | Illumina | SY-415-1001 |
| High-Output v2.5试剂盒（75循环） | Illumina | 20024906 | |
| 杂交捕获 | SureSelectXT试剂盒，HSQ | Agilent | G9611A |
| TS-p5 | IDT | 1016184 | |
| TS-p7 | IDT | 1016188 | |
| 扩增混合液 | 10x Genomics | 220119 | |
| AMPureXP SPRI磁珠 | Beckman Coulter | A63881 | |
| 测序 | NovaSeq 6000 | Illumina | 20012850 |
| S1试剂盒v1.5（200循环） | Illumina | 20028318 | |
| 文库定量 | KAPA文库定量试剂盒 | Kapa BioSystems | KK4873 |
| 测序（PD样本） | NextSeq 550 | Illumina | SY-415-1002 |
| High-Output v2.5试剂盒（150循环） | Illumina | 20024907 | |
| 文库扩增（PD） | 靶向基因表达检测 | 10x Genomics | CG000293 |
| 文库扩增试剂盒 | 10x Genomics | 1000249 | |
| PacBio文库构建 | SMRTbell Express模板制备试剂盒2.0 | Pacific Biosciences | 100-938-900 |
| PacBio测序 | Sequel II | Pacific Biosciences | 101-447-000 |
| MAS-seq文库构建 | MAS-Seq 10x单细胞3'试剂盒 | Pacific Biosciences | 102-659-600 |
| MAS-seq测序 | Sequel IIe | Pacific Biosciences | 101-986-400 |
| Revio | Pacific Biosciences | 102-090-600 | |
| 文库定量 | Qubit dsDNA高灵敏度检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | Q32854 |
| Femto-Pulse基因组DNA 165 kb试剂盒 | Agilent | FP-1002-0275 | |
| ONT文库构建 | NEBNext高保真2x PCR预混液 | New England Biolabs | M0541S |
| ProNex尺寸选择性纯化系统磁珠 | Promega | NG2001 | |
| 连接测序试剂盒 | Oxford Nanopore Technologies | SQK-LSK109 | |
| ONT测序 | GridION X5 | Oxford Nanopore Technologies | GRD-X5B002 |
| R9.4.1流动池 | Oxford Nanopore Technologies | FLO-MIN106D | |
| PromethION P48 | Oxford Nanopore Technologies | PRO-SEQ048 | |
| R9.4.1流动池 | Oxford Nanopore Technologies | FLO-PRO002 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞核分离 | 组织来源、组织量、裂解缓冲液、RNase抑制剂浓度、过滤孔径、离心条件 阅读提示：Methods: Nuclei isolation |
| 文库构建 | 10x Chromium版本、细胞加载量、文库制备试剂盒 阅读提示：Methods: Illumina single-nucleus RNA-seq and hybrid selection |
| 测序 | 测序平台、读长、测序深度 阅读提示：Methods: Illumina single-nucleus RNA-seq and hybrid selection; Results: Short-read data |
| 杂交捕获 | bait设计、目标基因、杂交捕获试剂盒、扩增循环数 阅读提示：Methods: Hybrid selection bait design; Results: Targeted sequencing |
| 长读测序 | 文库构建方法、平台、数据处理参数 阅读提示：Methods: PacBio RNA-seq, MAS-seq, ONT |
| ASE分析 | 分析流程参数（STARsolo、WASP）、参考基因组、SNP calling、统计模型 阅读提示：Methods: Read processing pipeline, Downstream analysis package; Results: ASE analysis pipeline |
| 统计检验 | 统计模型（beta-binomial, mixed model）、多重检验校正方法 阅读提示：Methods: Downstream analysis package; Results: Parkinson's disease SNP-level analysis |