突变位点筛选
筛选出可通过ABE校正且沉默荧光素酶活性的荧光素酶点位突变。
在HEK293T细胞中瞬转8个候选突变质粒，检测荧光素酶活性；通过共转ABE7.10和gRNA进行校正分析；在Flp-In T-Rex稳定细胞系中用ABE8e验证。
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一种用于优化体内基因编辑的荧光素酶报告小鼠模型，并通过脂质纳米颗粒递送腺嘌呤碱基编辑器进行验证
A luciferase reporter mouse model to optimize in vivo gene editing validated by lipid nanoparticle delivery of adenine base editors
实验完整度
高包含体外细胞系筛选（HEK293T、Flp-In T-Rex）、稳定细胞系生成、小鼠模型构建（CRISPR-HDR）、体内LNP递送、活体成像、组织荧光素酶测定及Sanger测序等多层级验证。
主要模型
HEK293T细胞 Flp-In T-Rex 293稳定细胞系 LumA小鼠（C57BL/6J背景） 野生型荧光素酶小鼠（阳性对照）
重点核对
LumA小鼠为纯合子，含R387X/T381T突变 LNP制剂：MC3或ALC-0315离子化脂质，N/P比为6 注射剂量：2 mg/kg总RNA，静脉注射 检测时间：注射后2天、7天及4个月 组织荧光素酶测定：肝脏、脾、肺、肌肉
摘要
CRISPR基因组编辑技术的快速发展为有效和精确治疗遗传疾病提供了潜力。然而，将基因组编辑器高效安全地递送到受影响的组织仍然是一个挑战。在这里，我们开发了发光ABE（LumA），一种荧光素酶报告小鼠模型，其小鼠基因组Rosa26位点的荧光素酶基因中含有R387X突变（c.A1159T）。该突变消除了荧光素酶活性，但可以通过SpCas9腺嘌呤碱基编辑器（ABEs）进行A到G的校正而恢复。通过静脉注射两种FDA批准的脂质纳米颗粒（LNP）制剂（由MC3或ALC-0315可电离阳离子脂质组成，包裹ABE mRNA和LucR387X特异性引导RNA（gRNA））对LumA小鼠模型进行了验证。全身生物发光活体成像显示，处理过的小鼠中，发光恢复持续长达4个月。与携带野生型荧光素酶基因的小鼠相比，通过组织荧光素酶测定，ALC-0315和MC3 LNP组的肝脏荧光素酶活性恢复分别为83.5%±17.5%和8.4%±4.3%。这些结果表明，成功开发了一种荧光素酶报告小鼠模型，可用于评估不同基因组编辑器、LNP制剂和组织特异性递送系统的功效和安全性，以优化基因组编辑疗法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 开发一种能够可视化并量化体内碱基编辑效率的报告小鼠模型，并验证其通过LNP递送ABE系统后的有效性。
- 核心机制
- ABE8e通过A-to-G转换校正荧光素酶基因中的R387X无义突变，恢复荧光素酶活性。
- 主要证据
- 在LumA小鼠中，静脉注射包裹ABE8e mRNA和gRNA的ALC-0315 LNP，肝脏组织荧光素酶活性恢复至野生型的83.5%±17.5%，且Sanger测序显示平均A-to-G编辑效率为24.6%±5%。
- 研究意义
- LumA小鼠模型为评估不同基因组编辑器、LNP制剂和组织特异性递送系统提供了体内平台，有助于优化基因组编辑疗法。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
LumA小鼠模型构建
通过CRISPR-HDR将含R387X/T381T突变的荧光素酶基因敲入小鼠Rosa26位点，建立可报告体内碱基编辑的小鼠模型。
使用C57BL/6J小鼠胚胎显微注射SpCas9蛋白、gRNA和供体DNA，获得Founder小鼠，经多代回交和基因分型确认。
LNP制备与表征
制备包裹ABE8e mRNA和gRNA的LNP制剂，用于体内递送。
通过T型接头混合脂质混合物和含mRNA的水相，制备MC3和ALC-0315两种LNP制剂，并进行表征。
体内碱基编辑验证
验证LNP递送的ABE系统在LumA小鼠中修复突变并恢复荧光素酶活性。
对纯合LumA小鼠静脉注射LNP-ABE8e mRNA/gRNA或生理盐水，通过活体成像、组织成像、Sanger测序和组织荧光素酶测定评估编辑效率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Gibco | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | -- | |
| 潮霉素 | Gibco | -- | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| pcDNA3.1质粒 | Addgene | -- | |
| pcDNA5/FRT/TO载体 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ABE7.10质粒 | Addgene | -- | |
| ABE8e质粒 | -- | -- | |
| 引导RNA | Synthego | -- | |
| CRISPR RNA | IDT | -- | |
| tracrRNA | IDT | -- | |
| pOG44重组酶 | -- | -- | |
| 荧光素酶测定 | 双荧光素酶检测试剂盒 | Promega | -- |
| Steady Glo荧光素酶检测系统 | Promega | -- | |
| DNA提取 | DNeasy血液和组织试剂盒 | Qiagen | -- |
| 动物实验 | D-荧光素 | Cayman Chemical | -- |
| IVIS Lumina II成像系统 | Caliper Life Sciences | -- | |
| 组织荧光素酶测定 | FastPrep匀浆器 | MP Biomedicals | -- |
| 酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| 质粒构建 | HindIII限制性内切酶 | New England Biolabs | -- |
| ApaI限制性内切酶 | New England Biolabs | -- | |
| 细胞培养 | 96孔板 | Corning | -- |
| 48孔多聚-D-赖氨酸包被板 | -- | -- | |
| 6孔板 | Corning | -- | |
| LNP制备 | Spectra/Por 2透析袋 | Repligen | -- |
| Amicon Ultra-15离心过滤装置 | MilliporeSigma | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系突变筛选 | HEK293T细胞培养条件、转染试剂和量、质粒浓度、检测时间 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and transfections; Figure 1C-D |
| 稳定细胞系生成 | Flp-In T-Rex系统、转染比例、筛选试剂浓度（潮霉素） 阅读提示：Materials and methods: Generation of Flp-In-T-Rex stable cell lines |
| LumA小鼠模型生成 | 显微注射用gRNA序列、供体DNA设计、 Founder鼠回交代数、基因分型引物 阅读提示：Materials and methods: Mouse embryo microinjections to generate the LumA mice; Mouse breeding |
| LNP制备与表征 | 脂质组成和N/P比、溶剂体系、流速、透析条件和浓缩方法 阅读提示：Materials and methods: LNP formulation; Table S1 |
| 体内基因编辑 | 小鼠品系和性别、注射剂量和途径、检测时间点、成像条件 阅读提示：Materials and methods: Animal experiments; Figure 2 |
| 组织分析 | 组织取材、匀浆条件、荧光素酶测定方法、数据标准化 阅读提示：Materials and methods: Tissue luciferase assay; Figure 2G |