核分数计算
量化每个液滴中来自未剪接核前体mRNA的RNA比例。
利用RNA片段映射到内含子区域的比例计算核分数，提供了基于区域标签（如Cell Ranger产生的）和基于基因注释文件两种映射方法。
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DropletQC：改进单细胞RNA-seq数据中空液滴和受损细胞的识别
DropletQC: improved identification of empty droplets and damaged cells in single-cell RNA-seq data
实验完整度
中方法开发并应用于多个已有数据集，包含细胞注释、方法比较和功能验证（如凋亡处理），但无湿实验操作，主要依赖计算分析。
主要模型
胚胎小鼠脑组织样本 胶质母细胞瘤肿瘤样本 外周血单核细胞（PBMC）样本 霍奇金淋巴瘤肿瘤样本
重点核对
核分数计算中intronic和exonic reads的定义与映射方法 空液滴和受损细胞识别的阈值参数（默认核分数差0.15，UMI降低50%） 细胞类型注释方法（标记基因或scPred）对受损细胞识别的影响 EmptyDrops过滤时UMI下界（100或500）及FDR阈值（1%）的设置
摘要
背景：基于液滴的单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的进步极大地提高了通量，使得单个实验中常规测序数万个细胞成为可能。除细胞外，液滴还捕获无细胞的“环境”RNA，这主要是由样品制备过程中细胞裂解引起的。环境RNA浓度高的样品会给准确区分含有细胞的液滴和含有环境RNA的液滴带来挑战。目前将这些群体分开的方法通常会保留大量不含细胞或空液滴的液滴。此外，目前还没有方法可以检测含有受损细胞的液滴，受损细胞包括部分裂解的细胞，是环境RNA的原始来源。结果：在这里，我们描述了DropletQC，一种新方法，能够检测空液滴、受损和完整的细胞，并准确地将它们彼此区分。该方法基于一种新的质量控制指标——核分数（nuclear fraction），它量化每个液滴中来自未剪接的核前体mRNA的RNA比例。我们展示了DropletQC如何为现有的识别空液滴的计算方法（如EmptyDrops）提供强大的扩展。结论：我们将DropletQC实现为R包，可轻松整合到现有的单细胞分析工作流程中。补充信息：在线版本包含补充材料，可在10.1186/s13059-021-02547-0获取。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何改进基于液滴的scRNA-seq数据中空液滴和受损细胞的识别准确性？
- 核心机制
- 通过计算每个液滴的核分数（源自未剪接核前体mRNA的RNA比例），结合UMI计数，区分空液滴（低核分数）、受损细胞（高核分数）和完整细胞。
- 主要证据
- 在四种3'端数据集（小鼠脑、胶质母细胞瘤、PBMC、霍奇金淋巴瘤）中，DropletQC识别出额外的空液滴和受损细胞；通过MALAT1/NEAT1低水平验证空液滴无完整细胞，通过凋亡处理和线粒体基因含量验证受损细胞。
- 研究意义
- DropletQC提供了一种可以整合到现有单细胞分析流程中的方法，有助于提高scRNA-seq数据质量，尤其对于环境RNA含量高的样本。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞注释
为后续按细胞类型识别受损细胞提供细胞类型标签。
对每个样本进行细胞类型注释，使用标记基因或基于参考数据集的监督分类（scPred）。
空液滴识别
识别不含细胞的空液滴，特别是那些被现有方法遗漏的。
通过核分数的核密度估计自动确定阈值，低于阈值的条码被判定为空液滴；提供用户可调参数进行校正。
受损细胞识别
识别含有受损细胞的液滴。
对每个细胞类型分别应用高斯混合模型和期望最大化，基于UMI计数和核分数区分受损和完整细胞。
额外数据集验证
验证DropletQC在不同实验条件下的适用性。
应用DropletQC到冷冻保存的猕猴小胶质细胞数据和不同凋亡状态的HEK293细胞数据，以及5'端协议的数据集。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 数据过滤 | EmptyDrops | -- | -- |
| CellBender背景去除 | -- | -- | |
| EmptyNN | -- | -- | |
| 细胞类型注释 | scPred | -- | -- |
| 数据处理 | 10x Genomics Cell Ranger | 10x Genomics | -- |
| DropletQC | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 核分数计算 | 内含子与外显子reads的计数方法，基因注释文件版本 阅读提示：Methods: Nuclear fraction calculation |
| 细胞过滤 | EmptyDrops参数（UMI下界100或500，FDR阈值1%），线粒体基因含量阈值15% 阅读提示：Methods: Cell filtering and annotation |
| 细胞类型注释 | 注释方法（标记基因或scPred）、参考数据集的选择 阅读提示：Methods: Cell filtering and annotation |
| 空液滴识别 | 核分数阈值自动选择或用户自定义参数，UMI阈值 阅读提示：Methods: Identifying empty droplets and damaged cells |
| 受损细胞识别 | 高斯混合模型组件数、收敛标准、默认参数（核分数差0.15，UMI降低50%） 阅读提示：Methods: Identifying empty droplets and damaged cells |