溶瘤病毒构建与体外扩增
制备表达IL-7和IL-12的重组溶瘤牛痘病毒（hIL-7/mIL-12-VV）及对照病毒（Cont-VV）。
基于LC16mO株，删除VGF和O1L，部分缺失B5R，插入hIL-7和mIL-12表达序列（均带SP启动子）；Cont-VV插入荧光素酶和红色荧光蛋白基因。病毒在A549细胞中扩增，Optiprep密度梯度离心浓缩，RK13细胞上标准空斑法滴定。
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与奥沙利铂联合通过重组肿瘤内巨噬细胞改善溶瘤病毒治疗的远隔效应
Combination with oxaliplatin improves abscopal effect of oncolytic virotherapy through reorganization of intratumoral macrophages
实验完整度
高包含体外细胞实验、动物模型（双侧LLC和CT26.WT肿瘤）、转录组分析（bulk RNA-seq和scRNA-seq）以及功能验证（抗体阻断、体内成像等）。
主要模型
LLC（Lewis肺癌）小鼠皮下移植瘤模型 CT26.WT（结肠癌）小鼠皮下移植瘤模型 双侧荷瘤小鼠模型（远隔效应评估）
重点核对
病毒剂量：hIL-7/mIL-12-VV 2×10^5、2×10^6、2×10^7 pfu 奥沙利铂剂量：10 mg/kg，腹腔注射 紫杉醇剂量：20 mg/kg，腹腔注射 IFN受体阻断抗体：500 μg，腹腔注射，三次 肿瘤接种细胞数：LLC 5×10^5；CT26.WT 5×10^5-1×10^6
摘要
瘤内给药是溶瘤病毒治疗中广泛使用的方法，因为它能使病毒颗粒直接进入靶肿瘤，并可能通过原位接种抑制未治疗的远处肿瘤。然而，由于病毒溶液的注射体积和浓度受到物理限制，剂量水平无法增加。此外，远处肿瘤的疗效需要提高以延长患者生存期。在此，我们证明了奥沙利铂的益处，并通过转录组分析揭示了详细机制，这可能为溶瘤病毒治疗的关键缺陷提供解决方案。在病毒注射的肿瘤中，奥沙利铂通过抑制I型干扰素改善了病毒的滞留。在远处未接受病毒的肿瘤中，奥沙利铂诱导了肿瘤内巨噬细胞特性的改变，导致活化T细胞的趋化和募集，随后在未注射的肿瘤中诱导炎症状态。我们的发现可能成为改变溶瘤病毒治疗对全身转移患者治疗范式的触发因素。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何通过联合用药解决溶瘤病毒治疗中病毒滞留不足和远隔效应有限的问题？
- 核心机制
- 奥沙利铂通过抑制I型干扰素信号，提高病毒注射肿瘤中的病毒滞留；在未注射的远处肿瘤中，奥沙利铂改变巨噬细胞极化，从M2样抑制表型转变为M1样炎性表型，从而促进活化T细胞的募集和炎症状态。
- 主要证据
- 在双侧LLC肿瘤模型中，奥沙利铂联合溶瘤病毒显著抑制肿瘤生长，并增加远处肿瘤中CD8+ T细胞和效应分子的表达（RNA-seq和scRNA-seq）；抗体阻断IFN信号模拟了病毒滞留效应。
- 研究意义
- 研究提出奥沙利铂联合溶瘤病毒治疗可能解决临床中溶瘤病毒治疗的系统性转移挑战，为联合治疗策略提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内抗肿瘤疗效评估
评估奥沙利铂或紫杉醇联合不同剂量溶瘤病毒对肿瘤生长的抑制效果。
LLC细胞皮下接种于C57BL/6小鼠右侧腹部，肿瘤体积约50 mm3时随机分组。病毒（PBS或hIL-7/mIL-12-VV，剂量2×10^5、2×10^6、2×10^7 pfu）瘤内注射，第一天腹腔注射奥沙利铂10 mg/kg或紫杉醇20 mg/kg。监测肿瘤体积和体重。
病毒滞留检测
检测奥沙利铂对瘤内病毒载量和病毒分布的影响。
通过qPCR测量肿瘤和血液中的病毒DNA；使用基因工程病毒（Cont-VV）结合活体成像监测荧光素酶信号。
转录组分析（bulk RNA-seq和scRNA-seq）
揭示奥沙利铂联合溶瘤病毒对肿瘤转录组的影响，特别是I型干扰素信号和巨噬细胞状态。
对病毒注射肿瘤和远处肿瘤进行bulk RNA-seq；对远处肿瘤进行scRNA-seq，聚类分析细胞亚群，并轨迹分析巨噬细胞极化。
流式细胞术分析肿瘤浸润淋巴细胞
量化治疗对肿瘤内免疫细胞亚群（如CD8+ T细胞、Tregs、巨噬细胞）的影响。
肿瘤组织经解离后染色，使用流式细胞仪分析CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、FoxP3+ Tregs、F4/80+巨噬细胞等。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 病毒构建 | Optiprep密度梯度介质 | Axis-Shield | -- |
| 细胞培养 | F-12K培养基 | ATCC | -- |
| DMEM培养基 | Merck | -- | |
| RPMI1640培养基 | Merck | -- | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 葡萄糖 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 动物实验 | 奥沙利铂（艾乐铂静脉输注液） | Yakult Honsha Co., Ltd | -- |
| 紫杉醇 | Sawai Pharmaceutical Co., Ltd | -- | |
| 磷酸盐缓冲液 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | -- | |
| 5%葡萄糖注射液 | Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc. | -- | |
| 活体成像 | VivoGlo荧光素 | Promega | -- |
| IVIS成像系统 | PerkinElmer | -- | |
| 抗体治疗 | 抗小鼠IFNα/β受体亚基1抗体（克隆MAR1-5A3） | BioXCell | -- |
| 小鼠IgG1（克隆MOPC-21） | BioXCell | -- | |
| 细胞因子检测 | T-PER组织蛋白抽提试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| gentleMACS组织解离器 | Miltenyi Biotec | -- | |
| RayBio人IL-7 ELISA试剂盒 | Ray Biotech, Inc. | -- | |
| Quantikine小鼠IL-12 p70 ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- | |
| Pierce 660nm蛋白测定试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 病毒基因组定量 | QIAamp DNA小提试剂盒 | Qiagen | -- |
| NanoDrop分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 中和抗体滴定 | CellTiter-Glo2.0发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | -- |
| EnSpire酶标仪 | PerkinElmer | -- | |
| 流式细胞术 | 肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- |
| eFluor 780可固定活力染料 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| MACSQuant Analyzer 10流式细胞仪 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 基因表达分析 | ISOGEN RNA提取试剂 | Nippongene | -- |
| Superscript VILO cDNA合成试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| RNA-seq | SMART-Seq v4超低输入RNA试剂盒 | Clontech | -- |
| TruSeq链式mRNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| Nextera XT DNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| scRNA-seq | Chromium Next GEM单细胞固定RNA样本制备试剂盒 | 10x Genomics | -- |
| Chromium固定RNA小鼠转录组试剂盒 | 10x Genomics | -- | |
| NextSeq 2000测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 肿瘤模型建立 | LLC细胞接种量（5×10^5）和CT26.WT细胞接种量（5×10^5-1×10^6）；接种部位（皮下）；肿瘤体积达到约50 mm3时开始治疗。 阅读提示：Materials and Methods: Animal experiments |
| 病毒注射 | 病毒剂量（2×10^5, 2×10^6, 2×10^7 pfu）；注射体积（30 μL）；注射时间（第1,3,6天） 阅读提示：Materials and Methods: Animal experiments |
| 化疗药物给药 | 奥沙利铂剂量（10 mg/kg）和紫杉醇剂量（20 mg/kg）；给药途径（腹腔注射）；给药时间（第1天） 阅读提示：Materials and Methods: Animal experiments |
| IFN信号阻断 | 抗IFNα/β受体抗体（MAR1-5A3）和对照IgG1（MOPC-21）的剂量（500 μg）；给药时间（病毒治疗前1天，治疗后1,2天）；给药途径（腹腔注射） 阅读提示：Materials and Methods: Animal experiments |
| 病毒检测 | qPCR检测病毒DNA的方法（引物、探针） 阅读提示：Materials and Methods: Quantification of viral genomes |
| 流式细胞术 | 使用的抗体克隆和荧光标记；肿瘤解离方案；染色方案 阅读提示：Materials and Methods: Flow cytometry |