训练数据构建
为模型提供多物种、多组织的RNA剪接定量标注
处理人类、恒河猴、小鼠、大鼠四个物种心脏、肝脏、脑、睾丸共约100个样本的RNA-seq数据，使用STAR比对、MMR处理多映射读段，SpliSER计算剪接位点使用量（SSE），按染色体划分训练集和测试集。
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使用Pangolin从DNA序列预测RNA剪接
Predicting RNA splicing from DNA sequence using Pangolin
实验完整度
高包含多物种多组织RNA-seq数据训练与独立测试集验证，并在MFASS、MaPSy、FAS外显子6、DGN sQTL、BRCA1饱和基因组编辑及ClinVar等多项独立数据集上评估。
主要模型
人类、恒河猴、小鼠、大鼠的心脏、肝脏、脑和睾丸RNA-seq数据 HAP1细胞系（BRCA1饱和基因组编辑） minigene报告基因（MFASS、FAS外显子6）
重点核对
测试集：人类染色体1、3、5、7、9上的基因 训练集：人类其余染色体及非直系同源的其他物种基因 剪接位点注释：至少2个样本中支持1个分裂读段 组织特异性剪接评估：使用Spearman相关系数
摘要
深度学习的最新进展极大地改善了从DNA序列预测RNA剪接的能力。在此，我们提出Pangolin，一种用于预测多种组织中剪接位点强度的深度学习模型。在各种预测任务中，Pangolin在预测RNA剪接方面优于最先进的方法。Pangolin提高了对遗传变异对RNA剪接影响的预测，包括常见、罕见和谱系特异性遗传变异。此外，Pangolin以高准确率和召回率识别功能丧失突变，特别是对于非错义和无义突变，显示出识别致病性变异的重要潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何从DNA序列准确预测RNA剪接，包括不同组织中的剪接位点使用及遗传变异对剪接的影响？
- 核心机制
- Pangolin通过深度卷积神经网络学习剪接位点上下游最多5000 bp的序列特征，输出剪接位点概率和使用量，实现多组织预测，并利用多物种、定量标签提升性能。
- 主要证据
- Pangolin在预测剪接位点准确性（top-1准确率79% vs SpliceAI 75%）、遗传变异效应（MFASS AUPRC 0.56 vs SpliceAI 0.47）、多突变预测（FAS外显子6 Spearman r=0.79/0.80）以及致病性变异识别（BRCA1 AUPRC 0.95）方面均有提升。
- 研究意义
- Pangolin可识别影响剪接的非错义非无义致病性变异，有助于疾病基因的变异功能解读。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
模型训练
训练Pangolin模型学习剪接位点概率和使用量
采用16个残差块和跳跃连接的膨胀卷积网络，输入长度N≥10001（预测时为10001）的one-hot编码序列，输出12维向量预测四个组织的剪接概率和使用量。训练中使用AdamW优化器、余弦退火学习率、交叉熵损失，并分组织分标签类型训练，最终取5次训练模型的平均预测。
剪接位点预测性能评估
评估Pangolin预测剪接位点的准确性
在测试集上计算top-1、top-0.5准确率和AUPRC，并与SpliceAI、MMSplice、HAL、MaxEntScan比较。
遗传变异效应预测评估
评估Pangolin预测遗传变异对剪接影响的准确性
使用MFASS数据集（27,733个变异）评估区分剪接破坏性变异的能力；使用MaPSy数据集评估与体内剪接效率的相关性；使用FAS外显子6数据评估预测单变异和多变异效应的表现。
应用：组织特异性剪接预测
评估Pangolin预测组织特异性剪接差异的能力
在测试基因中筛选高置信度剪接位点，比较观察到的和预测的组织使用量差异，计算Spearman相关系数。
应用：人类-黑猩猩剪接差异分析
识别导致物种间剪接位点使用差异的DNA变异
使用人类、黑猩猩、恒河猴前额叶皮层RNA-seq数据，比较剪接位点使用差异，并用Pangolin预测变异效应，结合Liftoff注释，筛选出单个变异解释的差异位点。
应用：疾病基因变异功能预测
预测已知疾病基因中影响剪接的变异，并评估其识别致病性变异的能力
使用BRCA1饱和基因组编辑数据（3893个变异）和ClinVar数据，计算变异对剪接的影响，用AUPRC评估区分功能丧失变异和良性变异的能力。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 数据比对 | STAR 2.7.5 | -- | -- |
| 多映射读段处理 | MMR | -- | -- |
| 剪接位点定量 | SpliSER 1.3 | -- | -- |
| 基因注释 | Liftoff | -- | -- |
| 转录本定量 | RSEM 1.3.3 | -- | -- |
| 评估 | scikit-learn | -- | -- |
| 数据处理 | 外显子组聚合联盟（ExAC） | -- | -- |
| 变异数据库 | ClinVar数据库 | -- | -- |
| 模型预测 | Pangolin | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 训练和测试集构建 | 染色体划分、物种选择、样本量、剪接位点标记标准、使用量计算参数 阅读提示：Methods：Generating training and test sets |
| 模型训练 | 网络架构（16个残差块、卷积层）、训练参数（学习率、周期、批大小）、损失函数、优化器 阅读提示：Methods：Deep neural network architecture, Training Pangolin |
| 剪接位点预测评估 | 测试集定义、评估指标（top-1、top-0.5、AUPRC）、对比方法参数 阅读提示：Methods：Evaluation on held-out test set |
| 遗传变异效应评估 | 数据集、变异定义、评分方法、相关性计算 阅读提示：Methods：MFASS and MaPSy evaluation, FAS exon 6 evaluation |
| 组织特异性剪接 | 筛选标准、表达阈值、差异定义、统计方法 阅读提示：Methods：Tissue-specific splicing |
| 疾病基因变异预测 | BRCA1和ClinVar数据版本、评分方法、分类标准 阅读提示：Methods：BRCA1 evaluation and ClinVar prediction |