菌株收集与鉴定
收集并确认大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌临床分离株。
从56家美国医院连续收集19 453株分离株,必要时用MALDI-TOF MS确认菌种。
Trends of β-Lactamase Occurrence Among Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in United States Hospitals During a 5-Year Period and Activity of Antimicrobial Agents Against Isolates Stratified by β-Lactamase Type
多中心前瞻性监测,包括药敏试验、全基因组测序筛选、新酶克隆表达及表型特征描述等多层级验证。
大肠埃希菌临床分离株 肺炎克雷伯菌临床分离株
筛选标准:至少2种监测β-内酰胺(头孢他啶、头孢曲松、氨曲南、头孢吡肟)MIC≥2 mg/L或碳青霉烯耐药 药敏试验采用CLSI参考肉汤微量稀释法 β-内酰胺酶基因鉴定采用全基因组测序 趋势分析使用线性回归模型斜率系数 新CTX-M和OXA-1变体在E coli DH5α中克隆表达并测定MIC
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
收集并确认大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌临床分离株。
从56家美国医院连续收集19 453株分离株,必要时用MALDI-TOF MS确认菌种。
测定所有分离株对不同抗菌药物的敏感性。
采用参考肉汤微量稀释法进行药敏试验,并按CLSI标准判读。
鉴定符合筛选标准的分离株的β-内酰胺酶基因。
对MIC≥2 mg/L的分离株进行全基因组测序,使用SPAdes组装后与NCBI耐药基因数据库比对。
确定新发现的CTX-M和OXA-1变体的水解谱。
将新变体基因克隆到pCR-Blunt II并转入E coli DH5α,测定克隆株对多种β-内酰胺的MIC。
分析β-内酰胺酶发生率在研究期间的时间趋势。
采用线性回归模型分析年度百分比变化,确定趋势是否显著。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 菌种鉴定 | MALDI Biotyper | Bruker Daltonics | -- |
| 基因测序 | Nextera XT文库制备试剂盒 | Illumina | -- |
| MiSeq测序仪 | Illumina | -- | |
| 克隆表达 | Q5 2X PCR预混液 | New England Biolabs | -- |
| NEB 5-alpha感受态细胞 | New England Biolabs | C2987H | |
| DNA清洁浓缩-5试剂盒 | Zymo Research | -- | |
| Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒 | Invitrogen | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 菌株收集 | 参与医院的入组标准:需在2016-2020年每年提交分离株;感染类型分布 阅读提示:Methods, Bacterial Isolates |
| 药敏试验 | 质控菌株种类;培养基和培养条件(文中未明确说明);接种菌量(文中未明确说明) 阅读提示:Methods, Susceptibility Testing |
| β-内酰胺酶筛选 | 筛选标准:至少2种β-内酰胺MIC≥2 mg/L或碳青霉烯MIC≥2 mg/L;DNA提取和测序文库制备的具体量(文中未明确说明) 阅读提示:Methods, β-Lactamase Screening |
| 全基因组测序和分析 | 测序平台(MiSeq);目标覆盖度(30X);组装参数(SPAdes 3.9.0, K-values 21,33,55,77,99);比对标准(>94%同一性,40%最小覆盖度) 阅读提示:Methods, β-Lactamase Screening |
| 新变体克隆和表征 | 克隆载体(pCR-Blunt II);宿主(E coli DH5α);筛选抗生素(卡那霉素50 mg/L);引物序列 阅读提示:Methods, Characterization of β-Lactamase-Encoding Genes |
| 趋势分析 | 使用的统计模型(线性回归);软件(R Studio 2022.02.00);显著性定义(P<0.05) 阅读提示:Methods, Statistical Analysis |