临床队列建立与样本收集
收集SFTS住院患者临床数据及尿液、血浆样本，进行病毒载量检测和肾功能评估。
2021年5月至2022年9月期间，从南京医科大学第一附属医院纳入110例SFTS患者，排除8例未及时收集尿液者，最终102例患者纳入分析。采集入院时尿液和血浆样本，通过qRT-PCR定量病毒载量（U-SFTSV和P-SFTSV）。根据KDIGO标准评估肾功能，分为AKI组（n=28）和非AKI组（n=74）。
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尿液高病毒载量与重度发热伴血小板减少综合征住院患者急性肾损伤及不良预后相关：一种无创且便捷的预后标志物
A High Viral Load in Urine Correlates With Acute Kidney Injury and Poor Outcomes in Hospitalized Patients With Severe Fever With Thrombocytopenia Syndrome: A Noninvasive and Convenient Prognostic Marker
实验完整度
高包含临床队列分析（102例患者）、细胞感染实验（Vero E6细胞）和动物模型（IFNAR−/−小鼠）三个独立证据层级，并进行功能验证（病毒传染性）和机制验证（肾组织病理与免疫组化）。
主要模型
IFNAR−/− C57BL/6小鼠模型 Vero E6细胞 SFTS住院患者队列
重点核对
U-SFTSV载量（对数转换）与血浆SFTSV载量（r=0.624，P<.001）及肾损伤指标（sCr、BUN）的相关性 多因素Logistic回归中U-SFTSV的独立危险作用（OR=3.631, P=.019） U-SFTSV预测28天死亡风险的ROC曲线（AUC=0.881，cutoff=6379 copies/mL） 高U-SFTSV组（>6379 copies/mL）的Kaplan-Meier生存差异（log-rank P<.0001） 尿液病毒传染性实验（Vero E6细胞感染，Ct<35为阳性）
摘要
背景：重度发热伴血小板减少综合征（SFTS）是一种新发传染病，地理分布广泛且死亡率高。迄今为止，SFTS病毒（SFTSV）在尿液中的作用仍不明确。我们旨在探讨尿液中的布尼亚病毒与SFTS患者急性肾损伤（AKI）及死亡率之间的关系。方法：收集102例患者的尿液样本以定量尿液中的SFTSV载量（U-SFTSV）。在入院时评估患者肾功能。采用受试者工作特征（ROC）曲线和Logistic回归分析评估U-SFTSV的预测价值。对10份尿液样本在Vero细胞中进行病毒传染性实验。结果：U-SFTSV水平与血浆SFTSV载量（r = 0.624）及肾损伤指标呈正相关。U-SFTSV水平被确定为SFTS相关AKI的独立危险因素（比值比为3.631；P = .019）。U-SFTSV在预测SFTS患者死亡结局方面具有很高的价值，曲线下面积（AUC）为0.881。Kaplan-Meier生存比较显示，U-SFTSV水平大于6379拷贝/mL的患者在发病后28天内的死亡风险更高。此外，4份U-SFTSV水平高的尿液样本具有传染性。结论：我们的大型队列研究发现，U-SFTSV水平是SFTS患者发生AKI和不良预后的新型便捷无创预测生物标志物。尿液标本可能是SFTSV在人类中传播的来源。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 尿液中SFTSV载量（U-SFTSV）与SFTS患者急性肾损伤（AKI）的发生及不良预后是否相关，以及尿液是否具有传染性？
- 核心机制
- U-SFTSV水平与血浆病毒载量及肾损伤指标正相关，可能反映肾脏中病毒复制程度和肾损伤的严重性，高U-SFTSV水平提示更活跃的肾脏病毒复制和更严重的肾损伤，从而增加AKI和死亡风险。
- 主要证据
- 基于102例SFTS患者的临床队列，通过Spearman相关分析、多因素Logistic回归（U-SFTSV为AKI独立危险因素，OR=3.631, P=.019）和ROC分析（AUC=0.881）证明U-SFTSV的预测价值；10例尿液样本的Vero E6细胞感染实验显示4例高病毒载量尿液具有传染性；IFNAR−/−小鼠感染模型显示肾小管损伤及SFTSV-NP在间质中的分布，支持肾脏受累。
- 研究意义
- 作者提出U-SFTSV可作为识别AKI和潜在死亡风险的无创便捷的预测标志物，推荐入院时检测尿液病毒以指导临床管理，并提示尿液可能是人际传播的潜在来源，需要采取防护措施。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
相关性分析
分析U-SFTSV与血浆病毒载量、疾病严重程度及肾损伤指标的相关性。
使用Spearman相关分析评估U-SFTSV与P-SFTSV以及各项临床实验室指标（如血细胞计数、肝酶、肾功能指标等）的相关性。
急性肾损伤危险因素分析
确定U-SFTSV是否为SFTS相关AKI的独立危险因素。
比较AKI组与非AKI组患者的临床特征和实验室指标，进行单因素Logistic回归分析，将P<.01的变量纳入多因素Logistic回归，确定独立危险因素。
预后预测价值评估
评估U-SFTSV预测SFTS患者28天死亡结局的能力。
根据28天生存状态将患者分为存活组（n=87）和死亡组（n=15），比较两组特征。进行ROC分析确定U-SFTSV预测死亡的最佳截断值，并计算AUC。用Kaplan-Meier法比较截断值分组下的生存差异。
动物模型肾组织病理学与免疫组织化学
验证SFTSV在肾脏的复制和肾损伤的病理特征。
使用IFNAR−/− C57BL/6小鼠，分为模拟组和SFTSV感染组，皮下接种SFTSV（100μL，1.0×106 TCID50/mL）或DMEM。在感染后第5天收集肾组织，进行H&E染色和IHC检测SFTSV核蛋白（NP）。
病毒传染性实验
检测SFTS患者尿液中的病毒是否具有感染性，探究尿液作为传播途径的可能性。
收集10份新鲜尿液样本，经0.22μm滤膜过滤并与DMEM按1:1稀释后，接种Vero E6细胞（1×105细胞/孔），培养5天后提取细胞RNA，通过qRT-PCR检测SFTSV核酸（Ct<35为阳性），判断病毒复制。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 样本采集 | 50毫升试管 | -- | -- |
| RNA提取 | 达安基因RNA提取试剂盒 | DAAN GENE | 广州，中国 |
| qRT-PCR | 特异性引物和探针 | -- | -- |
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Gibco Invitrogen | -- |
| 胎牛血清 | Gibco Invitrogen | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco Invitrogen | -- | |
| 磷酸盐缓冲液 | Gibco Invitrogen | -- | |
| 免疫组织化学 | SFTSV核蛋白单克隆抗体 | Cambridge Biologics | Boston, |
| 细胞感染实验 | Vero E6细胞 | ATCC | Manassas, |
| 实验耗材 | 0.22微米针头式过滤器 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者队列与样本收集 | 患者纳入标准：SFTS诊断标准（发热、血小板减少、SFTSV RNA阳性）；排除标准：其他病原体感染、基础肾病或严重全身性疾病、未收集尿液；尿液和血浆样本均于入院时采集并用于qRT-PCR检测；肾功能评估采用KDIGO标准。 阅读提示：详见Methods部分'Patients'和'Urine Collection and SFTSV Detection' |
| qRT-PCR检测病毒载量 | RNA提取试剂盒（DAAN GENE）；扩增循环参数：50°C 15min反转录，95°C 15min聚合酶激活，然后45个循环（94°C 15s变性，55°C 45s退火延伸）；Ct值>35定义为阴性。 阅读提示：详见Methods部分'Urine Collection and SFTSV Detection' |
| 相关性分析与危险因素分析 | 样本量为102例；Spearman相关分析；单因素Logistic回归后纳入P<.01的变量进行多因素分析；U-SFTSV的OR=3.631（95%CI 1.239-10.640），P=.019。 阅读提示：详见Results部分'High Levels of SFTSV Loads in Urine in SFTS-Associated AKI'及Table 1 |
| 预后预测与生存分析 | ROC分析评价U-SFTSV预测28天死亡的AUC=0.881，截断值6379 copies/mL；Kaplan-Meier生存分析比较截断值分组的28天死亡率，log-rank P<.0001。 阅读提示：详见Results部分'Predictive Value of SFTSV Loads in Urine for the Prognosis of SFTS'及Figure 2 |
| 动物模型肾组织病理与免疫组化 | 小鼠品系为IFNAR−/− C57BL/6，6-8周龄；感染剂量为100μL 1.0×106 TCID50/mL SFTSV皮下接种；mock组接种DMEM；感染后5天收集肾组织；H&E染色观察肾小管损伤；IHC检测SFTSV NP。 阅读提示：详见Methods部分'Histopathology and Immunohistochemistry of Animal Kidney' |
| 尿液病毒传染性实验 | 收集10份尿液样本；Vero E6细胞（ATCC）以1×105细胞/孔接种6孔板；尿液经0.22μm滤膜过滤，与DMEM按1:1稀释后，取1mL进行10倍连续稀释并感染细胞2小时；培养5天后提取RNA，qRT-PCR检测SFTSV，Ct<35为阳性。 阅读提示：详见Methods部分'Urinary SFTSV Infectivity' |