体外验证FnCas9和SpCas9的切割特性
比较FnCas9和SpCas9在体外对靶DNA的切割位点，以确认FnCas9的非靶链切割位点差异。
纯化FnCas9和SpCas9重组蛋白，对包含靶序列的PCR扩增子进行体外切割实验，并通过run-off测序分析切割位点。
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利用Francisella novicida的Cas9扩展引导编辑模式
Expansion of the prime editing modality with Cas9 from Francisella novicida
实验完整度
高包含体外切割实验、人体细胞系中的靶向编辑优化与验证、NGS分析、脱靶分析、同时编辑、机制探究及临床相关性分析等多个独立证据层级。
主要模型
HEK293FT细胞系 K562细胞系 U2OS细胞系 HeLa细胞系
重点核对
使用FnCas9(H969A)-RT进行HEK293FT等细胞系靶向编辑时，需核对pegRNA的PBS和RTT长度及linker长度。 使用PE3或PE4递送方式时，需核对ngRNA的靶向位置。 需核对各靶位点（HEK3, NRAS, c-Myc等）中的TT或AA插入效率。 脱靶分析基于in silico预测的候选位点。
摘要
引导编辑可以在目标基因中通过CRISPR切口酶形成切口后，利用逆转录酶诱导所需的碱基替换、插入或缺失。在本研究中，我们开发了一种技术，通过将逆转录酶与Francisella novicida Cas9（一种CRISPR-Cas9直系同源物）连接，可以在目标DNA序列中插入或替换外部碱基。使用FnCas9(H969A)切口酶，现有化脓性链球菌Cas9切口酶[SpCas9(H840A)]引导编辑的靶向限制被显著扩展，并且在人类细胞系中特异性地对靶基因诱导精确的引导编辑。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在探索使用Francisella novicida Cas9 (FnCas9)直系同源物是否能扩展引导编辑的靶向范围，并克服SpCas9引导编辑的PAM限制。
- 核心机制
- FnCas9(H969A)切口酶对非靶链的切割位点不同于SpCas9，导致引导编辑的RTT和PBS区域可扩展，从而扩大可编辑范围。
- 主要证据
- 通过体外切割实验、人体细胞系中的靶向编辑（HEK3, NRAS, c-Myc, EMX1）及NGS分析，证明了FnCas9(H969A)-RT可进行精确的TT或AA插入，且编辑范围比SpCas9(H840A)-RT更广。
- 研究意义
- FnCas9(H969A)-RT作为基于Cas9直系同源物的引导编辑器，有望扩展基因编辑的靶向范围，并可能通过进一步工程化或AAV递送应用于治疗人类疾病相关突变。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
优化FnCas9引导编辑器效果
通过调整linker长度、PBS和RTT长度以及ngRNA位置，优化FnCas9(H969A)-RT的编辑效率。
构建不同linker长度的FnCas9(H969A)-RT和不同PBS/RTT长度的pegRNA，在HEK293FT等细胞系中，通过共转染pegRNA、FnCas9(H969A)-RT表达质粒和ngRNA表达质粒，评估TT或AA插入效率。
比较FnCas9-RT和SpCas9-RT的编辑范围
直接比较FnCas9(H969A)-RT和SpCas9(H840A)-RT在相同靶序列上的编辑范围。
在HEK293FT细胞中，针对c-Myc和EMX1基因的相同靶序列，通过NGS分析比较不同切口位置（-6至+3）的碱基插入效率。
利用工程化FnCas9扩展PAM识别
通过引入RHA突变（E1369R, E1449H, R1556A）扩展FnCas9的PAM识别（YG PAM），进一步扩大引导编辑的靶向范围。
构建RHA-FnCas9(H969A)-RT，针对c-Myc基因中具有YG PAM的靶序列，比较其与SpCas9(H840A)-RT的TT插入效率。
分析临床致病变异覆盖范围
评估FnCas9(H969A)-RT和RHA-FnCas9(H969A)-RT在理论上覆盖ClinVar数据库中已知致病变异的比例。
基于in silico分析，将SpCas9(H840A)-RT、FnCas9(H969A)-RT和RHA-FnCas9(H969A)-RT的编辑范围与ClinVar数据库中的致病变异位置进行比对，计算覆盖比例。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白纯化 | pET28a-SpCas9表达载体 | -- | -- |
| pET28a-FnCas9表达载体 | -- | -- | |
| 异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷 | -- | -- | |
| Amicon Ultra 离心过滤器 | Amicon | -- | |
| RNA体外转录 | T7 RNA聚合酶 | NEB | -- |
| 鼠源RNase抑制剂 | NEB | -- | |
| GENECLEAN® Turbo 试剂盒 | MP Biomedicals | -- | |
| 体外切割实验 | QIAquick® PCR纯化试剂盒 | Qiagen | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| IMDM培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 细胞转染 | Amaxa电穿孔试剂盒 | Lonza | V4XC-2032 |
| SpCas9(H840A)-RT表达质粒 | Addgene | 132775 | |
| 基因组DNA提取 | DNeasy血液和组织试剂盒 | Qiagen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外切割实验 | 使用FnCas9和SpCas9重组蛋白的浓度、缓冲液成分、反应温度和时间。 阅读提示：Methods中'In vitro cleavage assay'部分 |
| 引导编辑优化 | pegRNA的linker长度、PBS和RTT长度、ngRNA的靶向位置、递送方法（PE3或PE4）、细胞类型及转染剂量。 阅读提示：Figure 1及Methods中'Design and cloning of the prime editor and pegRNA expression vectors'和'Cell culture and transfection'部分 |
| 编辑范围比较 | 靶序列（c-Myc, EMX1）的切口位置范围（-6至+3）、插入碱基类型（AA或TT）、递送方式。 阅读提示：Figure 2及Results部分 |
| PAM扩展实验 | RHA-FnCas9(H969A)-RT蛋白的突变位点（E1369R, E1449H, R1556A）、靶序列的PAM类型（YG）、递送方式。 阅读提示：Results部分及Figure 2d-g |
| 脱靶分析 | 用于预测脱靶位点的计算工具、比对参数、使用的细胞系和编辑位点。 阅读提示：Results部分及Figure S8 |