核糖体图谱和转录组测序
获取小麦籽粒响应热胁迫的翻译组和转录组全貌。
对5、10、15 DAA的籽粒进行42°C热胁迫处理1小时，构建Ribo-seq和RNA-seq文库，并进行高通量测序。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
翻译调控可塑性塑造小麦籽粒对热胁迫的适应
Translational regulation plasticity shapes wheat grain adaptation to heat stress
实验完整度
高包含核糖体图谱与RNA-seq的组学分析、双荧光素酶验证、Western blot、亚细胞定位、Co-IP及LCI实验，并进行品种关联分析。
主要模型
小麦籽粒（Triticum aestivum cv. Chinese Spring） 小麦原生质体 烟草叶片（N. benthamiana） 小麦品种群体（95份四倍体、221份六倍体）
重点核对
热胁迫处理：42°C处理1小时，取样时间点包括5、10、15 DAA 生物重复：至少2或3个生物学重复，每个重复混合5株植物的籽粒 uORF功能验证：使用GFP报告系统进行Western blot分析，使用双荧光素酶系统进行表达检测 lORF功能验证：亚细胞定位（核、内质网、P-body），LCI和Co-IP验证与HSP的相互作用 品种关联分析：使用FST和SSI评估热耐受性差异
摘要
背景：由于全球变暖导致的极端高温正日益威胁作物生产，植物已经进化出高度复杂的机制来应对恶劣的环境胁迫并生存。在翻译水平上，普通小麦如何响应高温仍然很大程度上未知。结果：我们使用核糖体图谱和高通量测序来研究小麦籽粒响应高温的翻译组。我们的研究揭示，热胁迫深刻重塑了翻译组景观，显著影响涉及翻译过程、籽粒发育和热胁迫响应的mRNA的翻译。一部分上游开放阅读框（uORFs）和RNA结合蛋白特异性地与它们在高温下相关的翻译组变化相关联。重复基因的差异翻译受uORFs表达不平衡的影响。有趣的是，高温刺激长链非编码RNA中小开放阅读框（lORFs）的表达。由关键热响应lORFs编码的微小蛋白定位于细胞区域，包括细胞核、内质网和P-body，并与热休克蛋白相互作用。此外，微小蛋白和RNA结合蛋白有助于小麦品种间的耐热性差异。结论：本研究为小麦耐热性中的翻译调控机制提供了新见解，加速作物遗传改良以优化气候适应性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 普通小麦籽粒响应高温的翻译调控机制尚不清楚，本研究旨在揭示其翻译组动态及关键调控元件。
- 核心机制
- 热胁迫重塑翻译组，影响翻译过程、籽粒发育和热响应相关mRNA；uORFs抑制mORF翻译，dORFs增强翻译；lORFs编码的微小蛋白与热休克蛋白相互作用，介导耐热性。
- 主要证据
- 基于核糖体图谱和RNA-seq，鉴定出11,343个差异翻译基因，24个热响应uORFs、31个dORFs；通过Western blot、双荧光素酶、亚细胞定位、LCI和Co-IP验证了uORF和lORF的功能。
- 研究意义
- 为小麦耐热性的翻译调控机制提供新见解，加速作物遗传改良以优化气候适应性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
差异翻译基因鉴定和聚类分析
识别热胁迫下的差异翻译基因，并分析其动态模式。
使用RiboDiff和deltaTE鉴定DTGs，进行K-means聚类和GO富集分析。
uORF和dORF功能验证
验证uORF和dORF对mORF翻译的调控作用。
选取TaHSFB1的CPuORF和TaFbox的uORF，构建GFP融合载体，在烟草叶片中表达，通过Western blot检测蛋白水平；使用双荧光素酶系统验证uORF对mORF翻译的抑制。
lORF功能验证
验证lORFs编码的微小蛋白在热胁迫响应中的作用。
选取lORF4、5、10、14进行实验。在烟草叶片中验证其热响应性（双荧光素酶）；在小麦原生质中观察亚细胞定位；通过LCI和Co-IP验证lORF10与TaHSP70-2A、lORF5与TaDnaJ-3B的相互作用。
品种关联分析
评估翻译调控相关基因和元件对小麦品种耐热性差异的贡献。
利用324份小麦品种的基因型和表型数据，计算FST和SSI，分析TaRBP42-6B和lncRNA.10499的变异与耐热性的关联。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 植物材料培养 | Master GreenPower CG T 400W E40 | Philips | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596018 |
| RNA-seq文库构建 | Hieff NGS MaxUp II 双模式mRNA文库制备试剂盒(用于Illumina) | Yeasen | 12300 |
| 核糖体图谱 | RNase I | Invitrogen | AM2294 |
| RNA酶抑制剂 | Invitrogen | AM2694 | |
| Ribo-Zero磁珠试剂盒 | -- | MRZSR116 | |
| Ribo-seq文库构建 | NEBNext多重小RNA文库制备试剂盒(用于Illumina) | New England Biolabs | -- |
| RT-qPCR | Hifair® AdvanceFast一步法RT-gDNA消化超混合液 | Yeasen | 11151 |
| Hieff UNICON®通用蓝色qPCR SYBR Green预混液 | Yeasen | 11184 | |
| CFX96实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| Western blot | 抗GFP抗体 | TransGen Biotech | HT801-01 |
| 抗Myc抗体 | TransGen Biotech | HT101-01 | |
| PVDF膜 | Bio-Rad | 162-0177 | |
| Clarity Western ECL底物 | Bio-Rad | 170-5060 | |
| ChemiScope 6000 化学发光成像系统 | -- | -- | |
| LCI | D-荧光素 | Coolaber | CL6928 |
| Night SHADE LB985 植物活体成像系统 | Berthold Technologies | -- | |
| 亚细胞定位 | 卡尔蔡司LSM900共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | -- |
| PCR扩增 | 2× Hieff Canace Gold PCR预混液 | Yeasen | 10149 |
| 蛋白质提取 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche LifeScience | -- |
| MG132 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 热胁迫处理 | 热胁迫温度、处理时长、取样时间点 阅读提示：Methods: Plant materials |
| 核糖体图谱 | 裂解缓冲液成分、RNase I用量、RNase抑制剂用量、rRNA去除方法 阅读提示：Methods: Ribosome profiling assays |
| RNA-seq | RNA提取试剂、文库构建试剂盒、测序平台 阅读提示：Methods: RNA-seq library construction and data analysis |
| uORF功能验证 | 载体、表达系统、检测方法（Western blot、双荧光素酶） 阅读提示：Methods: Protein extraction and protein gel blot analysis; Dual-luciferase reporter system and reverse transcription quantitative PCR |
| lORF功能验证 | 亚细胞定位、LCI、Co-IP条件 阅读提示：Methods: Subcellular localization; Luciferase complementation imaging (LCI) assay; Co-immunoprecipitation (Co-IP) assay |
| 品种关联分析 | 基因型数据、表型数据、FST计算参数、SSI计算 阅读提示：Methods: Genomic variation analysis |