患者队列和样本收集
建立用于评估诊断方法的患者队列
连续收集117例BCP-ALL患者的骨髓样本，包括EDTA或肝素抗凝样本，用于细胞遗传学和分子遗传学分析。
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RNA测序和阵列CGH在AIEOP-BFM ALL 2017试验急性淋巴细胞白血病诊断工作流程中的应用
Implementation of RNA sequencing and array CGH in the diagnostic workflow of the AIEOP-BFM ALL 2017 trial on acute lymphoblastic leukemia
实验完整度
高该研究包含患者队列样本，结合核型分析、FISH、RT-PCR、RNA测序和阵列CGH等多种验证方法，并明确了验证结果和局限性。
主要模型
儿童B细胞前体急性淋巴细胞白血病患者队列 骨髓样本
重点核对
队列包含117名BCP-ALL患者，中位年龄4.8岁 RNA测序使用TruSight RNA Pan-Cancer Panel，每个样本至少300万reads 阵列CGH使用400k SurePrint G3 Custom CGH微阵列，ADM-2算法，阈值6.0 IKZF1plus通过阵列CGH检测，定义为IKZF1缺失至少一个额外缺失 融合检测通过FISH、RT-PCR和RNA测序，不一致病例需第二方法验证
摘要
风险适应性治疗显著提高了儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）的生存率，染色体畸变的可靠检测对于风险分层是强制性的。本研究评估了基于panel的RNA测序和阵列CGH在国际AIEOP-BFM ALL 2017试验德国研究组的诊断工作流程中的适用性。在117名B细胞前体（BCP）ALL儿童的连续队列中，阵列分析确定了12例IKZF1plus基因缺失谱和1例隐匿性亚二倍体。遗传标记BCR-ABL1（n = 1）、ETV6-RUNX1（n = 25）和涉及KMT2A（n = 3）或TCF3（n = 3）的重排通过已建立的常规技术如核型分析、FISH和RT-PCR进行评估。将这些结果与RNA测序分析进行比较，发现总体一致性为115/117例，尽管RNA测序中有一例AFF1-KMT2A融合未被检测到，常规分析中有一例ETV6-RUNX1融合未被检测到。RNA测序、FISH和CGH+SNP阵列的联合应用可靠地检测了风险分层所需的所有遗传标记，并将作为AIEOP-BFM ALL 2017研究中BCP-ALL患者的诊断标准工作流程。展望未来，持续收集全基因组CGH+SNP阵列以及RNA测序数据将是阐明儿童ALL既定标记之外新的预后病变的宝贵来源。在这方面，RNA测序在高达一半的IKZF1plus（n = 6/12）和B-other（n = 19/36）病例中识别出各种基因融合，但在超二倍体核型病例（n = 35）中未发现。在这些融合中，本研究报道了几种以前未描述的框内PAX5融合，包括PAX5-MYO1G和PAX5-NCOA6。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 评估基于panel的RNA测序和阵列CGH在AIEOP-BFM ALL 2017试验诊断工作流程中的适用性，以及它们与传统方法（核型分析、FISH、RT-PCR）在检测风险相关遗传标记方面的一致性。
- 核心机制
- 文中未明确说明。
- 主要证据
- 在117例BCP-ALL患者中，RNA测序与常规方法在115例中结果一致，个别融合未检出；阵列CGH识别出12例IKZF1plus和1例隐匿性亚二倍体。
- 研究意义
- 结合RNA测序、FISH和CGH+SNP阵列可可靠检测风险分层的遗传标记，并作为AIEOP-BFM ALL 2017研究的诊断标准工作流程，同时积累的数据有助于发现新的预后标志物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
常规细胞遗传学分析（核型分析、FISH）
检测风险相关的融合基因和染色体畸变，如BCR-ABL1、ETV6-RUNX1、KMT2A和TCF3重排
对骨髓样本进行短期培养，通过R显带和FISH分析染色体畸变。
RT-PCR检测融合转录本
验证常规方法检测的融合基因
对EDTA材料样本进行RT-PCR，检测BCR-ABL1、ETV6-RUNX1和AFF1-KMT2A融合转录本。
基于panel的RNA测序
检测已知和新的融合转录本
使用TruSight RNA Pan-Cancer Panel进行RNA测序，分析融合转录本。
阵列CGH检测拷贝数畸变和IKZF1plus
检测全基因组拷贝数变化，特别是IKZF1plus基因缺失谱
对未检出风险标记的患者进行阵列CGH分析。
RNA测序融合的验证
确认RNA测序检测到的融合
通过FISH、HemaVision-28N RT-PCR或回顾性核型分析验证RNA测序融合。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA分离 | Chemagic 360 | PerkinElmer | -- |
| RNA质量评估 | Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | -- |
| DNA分离 | QIAamp DNA Blood Midi试剂盒 | Qiagen | -- |
| FISH | Vysis LSI BCR/ABL双色探针 | Abbott | -- |
| Vysis LSI ETV6(TEL)/RUNX1(AML1) ES双色探针 | Abbott | -- | |
| Vysis LSI MLL(KMT2A)双色探针 | Abbott | -- | |
| SureFISH 19p13.3 TCF3 DF探针 | Agilent | -- | |
| RNA测序 | TruSight RNA泛癌panel | Illumina | -- |
| MiSeq试剂盒v3（150循环） | Illumina | -- | |
| MiSeq流动槽 | Illumina | -- | |
| RNA测序验证 | HemaVision-28N多重RT-PCR试剂盒 | DNA Diagnostic | -- |
| 阵列CGH | 400k SurePrint G3定制CGH人类基因组微阵列 | Agilent Technologies | -- |
| Megapool参考DNA | Kreatech | -- | |
| 阵列CGH分析 | Agilent Genomic Workbench 7.0 | Agilent Technologies | -- |
| SNP阵列 | CGH+SNP阵列（e-Array设计85320） | Agilent Technologies | -- |
| 人类参考DNA | Agilent Technologies | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者队列 | 117例BCP-ALL患者，德国中心治疗，参加AIEOP-BFM ALL 2009试验 阅读提示：Methods: Patients and samples |
| 样本处理 | 骨髓穿刺，RNA从EDTA骨髓分离，DNA从EDTA骨髓分离 阅读提示：Methods: Patients and samples |
| FISH分析 | 短时培养24-48小时，FISH探针类型 阅读提示：Methods: Karyotyping and FISH analysis |
| RT-PCR | 有EDTA材料时进行，检测BCR-ABL1、ETV6-RUNX1、AFF1-KMT2A 阅读提示：Methods: Reverse transcriptase PCR |
| RNA测序 | TruSight RNA Pan-Cancer Panel，每个样本至少300万reads，MiSeq平台 阅读提示：Methods: Panel-based RNA sequencing and data analysis |
| 阵列CGH | 400k SurePrint G3 Custom CGH微阵列，ADM-2算法，阈值6.0，至少4个异常探针 阅读提示：Methods: Array CGH |
| IKZF1plus检测 | 阵列CGH检测IKZF1、CDKN2A、CDKN2B、PAX5、CRLF2-P2RY8缺失和ERG状态 阅读提示：Methods: Array CGH |