分离成骨细胞和对照细胞
从再生鳍和未受伤鳍中分离成骨细胞（sp7+）和其他细胞（sp7−），用于后续组学分析。
使用Tg(sp7:EGFP)转基因斑马鱼，通过FACS分离sp7+和sp7−细胞，从未受伤鳍和4 dpa再生胚基中获取。
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斑马鱼鳍再生的表观基因组以稳定的谱系特异性DNA甲基化和动态染色质可及性为特征
Regenerating zebrafish fin epigenome is characterized by stable lineage-specific DNA methylation and dynamic chromatin accessibility
实验完整度
高包含WGBS、ATAC-seq、RNA-seq等多组学分析，转基因增强子活性验证，以及CRISPR-Cas9基因敲除功能验证，属于多层级功能验证。
主要模型
斑马鱼尾鳍再生模型 Tg(sp7:EGFP)转基因斑马鱼 成骨细胞（sp7+细胞） fosl1a突变斑马鱼
重点核对
使用Tg(sp7:EGFP)转基因斑马鱼分离成骨细胞 再生时间点：0、1、2、4 dpa WGBS平均覆盖率25.1x，CpG覆盖≥5x占79% 增强子活性验证使用转基因报告系统 fosl1a敲除导致再生延迟
摘要
背景：斑马鱼可以通过形成胚基（一种增殖细胞团，可以生长并发育成失去的身体部分）来忠实地再生受伤的鳍。截肢后，各种细胞类型对胚基的形成做出贡献，其中每种细胞类型都保持命运限制，并仅对其自身谱系的再生做出贡献。与再生过程中谱系限制相关的表观遗传变化仍未得到充分研究。结果：我们绘制了未受伤和再生鳍中成骨细胞和其他细胞的表观基因组图谱，包括DNA甲基化和染色质可及性，以及转录组。这项工作揭示再生是一个高度动态和协调的转录组和染色质可及性变化过程，同时伴随着稳定维持的谱系特异性DNA甲基化。表观遗传特征还揭示了许多新的再生特异性增强子，并经过实验验证。通过表观基因组图谱的整合分析构建了对再生重要的调控网络，敲除预测的上游调节因子会扰乱正常再生，验证了我们的预测。结论：我们的研究表明，谱系特异性DNA甲基化特征在再生过程中稳定维持，再生增强子在损伤前预设为低甲基化。相比之下，染色质可及性在再生过程中动态变化。通过整合表观基因组分析，识别并验证了许多驱动再生基因表达的增强子以及再生的上游调节因子。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在斑马鱼鳍再生过程中，细胞命运限制如何与DNA甲基化和染色质可及性的表观遗传变化相关联？
- 核心机制
- 谱系特异性DNA甲基化在再生过程中稳定维持，而染色质可及性动态变化，再生增强子预先处于低甲基化状态，损伤后获得染色质可及性并激活再生基因表达。
- 主要证据
- 通过WGBS和ATAC-seq分析发现DNA甲基化稳定、染色质可及性动态变化，并通过转基因增强子实验和CRISPR-Cas9敲除上游转录因子Fra1验证其功能。
- 研究意义
- 揭示DNA甲基化维持细胞命运记忆、染色质可及性驱动再生基因表达，为理解再生机制和潜在再生能力提供表观遗传学基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
全基因组DNA甲基化分析
评估再生过程中DNA甲基化是否发生变化。
对sp7+和sp7−细胞进行WGBS测序和DMR分析。
转录组分析
识别再生过程中差异表达的基因。
对相同细胞进行RNA-seq，分析差异表达基因。
染色质可及性分析
检测再生过程中染色质可及性的变化。
对相同细胞进行ATAC-seq，识别DARs。
再生增强子的体内验证
验证预测的再生增强子的活性。
将候选增强子克隆到报告载体，通过转基因斑马鱼检测GFP表达。
基因调控网络构建和功能验证
识别上游调控因子并验证其功能。
通过motif富集和足迹分析构建网络，预测Fra1为上游因子，并通过CRISPR敲除验证。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞分离 | TrypLE Express酶 | Gibco | -- |
| Liberase DL | Roche | -- | |
| 细胞解离缓冲液 | Gibco | -- | |
| 细胞分选 | FACS Aria II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Ambion | -- |
| TURBO DNase | Ambion | -- | |
| RNA/DNA定量 | Qubit荧光计 | Invitrogen | -- |
| DNA提取 | NanoVue | GE Healthcare Life Sciences | -- |
| WGBS | EZ DNA甲基化直接试剂盒 | Zymo Research | -- |
| TruSeq DNA甲基化试剂盒 | Illumina | -- | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| RNA-seq | TruSeq RNA文库制备试剂盒v2 | Illumina | -- |
| ATAC-seq | Nextera DNA样本制备试剂盒 | Illumina | -- |
| MinElute PCR纯化试剂盒 | Qiagen | -- | |
| 增强子验证 | ZEDtw载体 | -- | -- |
| CRISPR | pT2-U6chr21-gRNAscaffold载体 | -- | -- |
| Tol2转座酶mRNA | -- | -- | |
| Hi-Speed Mini质粒提取试剂盒 | IBI | IB47102 | |
| qRT-PCR | ProtoScript II逆转录酶 | NEB | M0368 |
| PerfeCTa SYBR Green SuperMix | Quantabio | 95054 | |
| Bio-Rad CFX96仪器 | Bio-Rad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 斑马鱼饲养与截肢 | 斑马鱼品系、年龄、水温、截肢比例（50%）、截肢后水温28.5°C 阅读提示：Methods: Zebrafish maintenance and procedures |
| 细胞分离 | 使用Tg(sp7:EGFP)转基因斑马鱼，FACS分选，未受伤鳍和4 dpa胚基，酶消化条件（TrypLE Express 37°C 30-60min，Liberase DL 37°C 30min） 阅读提示：Methods: Isolation of sp7+ and sp7− cells |
| WGBS | DNA起始量、lambda DNA对照、文库制备试剂盒、测序平台、生物信息学参数（Trim Galore!、Bismark） 阅读提示：Methods: WGBS library generation, sequencing and mapping |
| RNA-seq | RNA起始量、文库制备试剂盒、测序平台、比对和定量方法（STAR、featureCounts、DESeq2） 阅读提示：Methods: RNA-seq library generation, sequencing and mapping |
| ATAC-seq | 细胞数、转座酶反应条件、测序平台、peak calling和DAR分析参数 阅读提示：Methods: ATAC-seq library generation, sequencing, and mapping; Identification of ATAC peaks and DARs |
| 增强子验证 | 载体、候选增强子克隆、显微注射和转基因斑马鱼建立 阅读提示：Methods: In vivo activity validation of regeneration enhancers |
| CRISPR敲除 | gRNA设计、注射浓度、热激条件、突变体筛选和基因型鉴定 阅读提示：Methods: Generation of mutant zebrafish with CRISPR/Cas9 genome editing |