验证表达蛋白的抗原完整性
确认由pJHL204载体表达并纯化的RBD蛋白是否保持天然构象和抗原性，以支持其作为疫苗抗原的可行性。
将RBD克隆至pJHL204载体并融合FLAG标签，电转化至沙门氏菌后感染RAW细胞表达，通过anti-FLAG树脂纯化，利用SDS-PAGE分析纯度，并通过圆二色谱（CD）评估二级结构。通过Western blot和ELISA检测其与已知中和单克隆抗体的反应性。
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细菌介导的口服复制子mRNA疫苗候选株对抗原始型和德尔塔变异型SARS-CoV-2的保护作用
Bacteria-enabled oral delivery of a replicon-based mRNA vaccine candidate protects against ancestral and delta variant SARS-CoV-2
实验完整度
高包含体外蛋白表达与抗原性验证、小鼠免疫原性评估（体液与细胞免疫）、仓鼠攻毒保护实验及组织病理学分析等多个独立实验层级，并包含功能与机制验证。
主要模型
BALB/c小鼠 叙利亚仓鼠 Vero E6细胞 RAW细胞
重点核对
疫苗株JOL3014（S. Typhimurium JOL3000携带pJHL204-V-P2A） 免疫剂量与途径：小鼠肌注1×10^7 CFU单次，口服1×10^8 CFU两次间隔2周；仓鼠肌注2×10^7 CFU单次，口服2×10^8 CFU两次间隔2周 攻毒剂量：1×10^4 PFU SARS-CoV-2（亲本株或德尔塔变异株），攻毒后5天处死 中和抗体测定：MN50滴度，以完全抑制CPE的最高血清稀释度为准 IgA应答评估：经口服免疫的小鼠肺和肠道中sIgA滴度显著升高
摘要
持续的严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）演变导致了许多变异株的出现，造成疫苗效力的显著下降，并促使需要开发下一代疫苗以应对抗原多样性。在此，我们开发了一种基于Semliki森林病毒复制子的多价mRNA疫苗，靶向SARS-CoV-2的受体结合域（RBD）、七肽重复域（HR）、膜蛋白（M）和非结构蛋白13（nsp13）的表位。细菌介导的基因递送能够以极经济规模快速生产大量疫苗，并且特别允许无针大众接种。在免疫小鼠中检测到有利的T辅助（Th）1主导的强效抗体和细胞免疫应答。此外，免疫诱导了针对B.1.617.2德尔塔变异株（G分支）的强效交叉保护性中和抗体（NAbs）。我们记录了免疫途径对免疫球蛋白（Ig）A应答诱导的差异，口服途径引发强效黏膜分泌型IgA（sIgA）应答，这可能有助于口服免疫提供的增强保护。经口服免疫的仓鼠对肺部和鼻腔中的病毒复制完全受到保护。重要的是，该疫苗保护仓鼠免受SARS-CoV-2诱导的肺炎。这项研究为开发可行且有效的针对SARS-CoV-2及其变异株的口服mRNA疫苗提供了原理验证性发现。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探讨基于塞姆利基森林病毒复制子的多价mRNA疫苗通过细菌介导的口服递送是否能够诱导针对SARS-CoV-2及其变异株的保护性免疫应答。
- 核心机制
- 该疫苗利用SFV复制子增强mRNA扩增，并通过沙门氏菌靶向抗原呈递细胞。口服免疫诱导Th1偏向的全身免疫应答，并特异性地在呼吸道和肠道黏膜诱导sIgA应答，这可能有助于清除上呼吸道病毒并提供完全保护。
- 主要证据
- 仓鼠模型中，经口服免疫的动物在受到亲本株和德尔塔变异株攻击后，肺部均未检测到感染性病毒，且鼻腔盥洗液中病毒也完全清除；相比之下，肌注免疫组在德尔塔变异株攻击后仍可检测到病毒。此外，组织病理学分析显示口服免疫可完全保护免受病毒性肺炎。
- 研究意义
- 本研究为开发安全有效的口服复制子mRNA疫苗提供了原理验证，以预防SARS-CoV-2传播并控制大流行。细菌介导的递送平台可能为其他传染病的口服mRNA疫苗开发提供借鉴。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估小鼠中的免疫原性
评估pJHL204-V-P2A疫苗经肌肉或口服途径免疫BALB/c小鼠后诱导的体液和细胞免疫应答水平及类型。
小鼠分别经肌肉注射单次1×10^7 CFU或口服两次1×10^8 CFU（间隔2周）免疫。在末次免疫后3周收集血清和脾细胞，通过ELISA检测抗原特异性IgG及其亚类，通过流式细胞术分析CD4+和CD8+ T细胞比例及IFN-γ分泌，通过MTT和ELISpot评估脾细胞增殖和IFN-γ分泌细胞数量。
评估仓鼠中的体液免疫和交叉中和抗体
评估疫苗在仓鼠中诱导的全身IgG应答及对SARS-CoV-2原始株和德尔塔变异株的中和抗体滴度。
仓鼠经肌肉注射单次2×10^7 CFU或口服两次2×10^8 CFU（间隔2周）免疫，在末次免疫后3周收集血清。通过ELISA检测抗原特异性IgG，通过微量中和试验（MN）和IFA测定对活病毒（原始株和德尔塔变异株）的中和抗体滴度（MN50）。
评估仓鼠中的保护效力
评估疫苗经不同途径免疫后对仓鼠免受SARS-CoV-2原始株和德尔塔变异株攻击的保护效力，包括病毒复制、肺部病理和体重变化。
免疫仓鼠在末次免疫后3周接受1×10^4 PFU SARS-CoV-2（原始株或德尔塔变异株）经鼻内攻毒。在攻毒后5天处死动物，收集肺组织和鼻腔盥洗液，通过空斑实验和qRT-PCR定量病毒载量，通过H&E染色进行组织病理学检查，并监测体重变化。
评估黏膜免疫应答
评估免疫途径（口服vs肌注）对小鼠黏膜IgA应答的影响，以解释口服免疫在仓鼠中提供的更强保护。
BALB/c小鼠经肌肉或口服途径免疫后，在末次免疫后3周收集血清、肺组织和肠道盥洗液。通过ELISA检测血清IgA、肺组织sIgA和IgG以及肠道盥洗液sIgA的水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Lonza | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 细菌培养 | LB肉汤 | BD | -- |
| 蛋白表达与纯化 | 抗FLAG树脂 | Thermo Fisher Scientific | A36801 |
| 庆大霉素 | -- | -- | |
| Western Blot | SARS-CoV-2刺突RBD单克隆抗体 | Sino Biological | 40592-MM57 |
| ELISA | 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG | Southern Biotech | 1030-05 |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG1 | Southern Biotech | 1070-05 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG2a | Southern Biotech | 1080-05 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗仓鼠IgG | Southern Biotech | 6060-05 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgA | Southern Biotech | 1040-05 | |
| OPD底物 | -- | -- | |
| 细胞因子染色 | 布雷菲德菌素A | Thermo Scientific | 00-4506-51 |
| 流式细胞术 | FITC标记的抗CD8a抗体 | Miltenyi Biotec | -- |
| PerCPVio700标记的抗CD4抗体 | Miltenyi Biotec | -- | |
| PE标记的抗CD3e抗体 | Miltenyi Biotec | -- | |
| PE标记的IFN-γ抗体 | BioLegend | -- | |
| APC标记的IL-4抗体 | BioLegend | -- | |
| MACSQuant流式细胞仪 | Miltenyi Biotec | -- | |
| ELISpot | 小鼠IFN-γ ELISpot试剂盒 | R&D Systems | EL485 |
| 肺匀浆制备 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | 87786 |
| RBD表达与纯化 | ApaI限制酶 | NEB | R0114S |
| AscI限制酶 | NEB | R0558S | |
| CD光谱分析 | Chirascan CD光谱仪 | Applied Photophysics | -- |
| ELISA | 酶标仪 | Tecan | -- |
| 免疫荧光分析 | Alexa Fluor 488标记的驴抗兔IgG | Invitrogen | A21206 |
| DAPI | Sigma | D9542-1MG | |
| Leica荧光显微镜 | Leica Biosystems | -- | |
| 病毒载量测定 | RNA提取试剂盒 | GeneAll | 305-101 |
| cDNA合成试剂盒 | Elpis Biotech | EBT-1515 | |
| 肠道盥洗液制备 | EDTA (50 mM) | Samchun chemicals | -- |
| PMSF | Sigma | 10837091001 | |
| 脾细胞培养 | RPMI 1640培养基 | HiMedia | AL028A |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 疫苗菌株与制备 | 疫苗株JOL3014（S. Typhimurium JOL3000携带pJHL204-V-P2A）及其培养条件 阅读提示：Materials and methods, 疫苗生产部分 |
| 免疫方案 | 免疫剂量、途径、次数和间隔时间：小鼠肌注1×10^7 CFU单次，口服1×10^8 CFU两次间隔2周；仓鼠肌注2×10^7 CFU单次，口服2×10^8 CFU两次间隔2周 阅读提示：Materials and methods, 免疫和采样部分 |
| 攻毒实验 | 攻毒剂量（1×10^4 PFU）、途径（鼻内）、体积（30 μL）和攻毒后处死时间（5天） 阅读提示：Materials and methods, 攻毒研究部分 |
| 中和抗体测定 | 病毒用量（50 PFU）、血清稀释方式（2倍系列稀释）、孵育时间（2小时）和终点判定标准（完全抑制CPE的最高稀释度，MN50） 阅读提示：Materials and methods, 活病毒中和试验部分 |
| 黏膜IgA评估 | 肺匀浆和肠道盥洗液的稀释度（分别为1:50和1:200，以及1:100和1:1,000）以及ELISA中使用的抗体 阅读提示：Materials and methods, 肠道盥洗液/肺匀浆制备和ELISA部分 |