验证GRP/GRPR在AKI中的表达上调
确认GRP/GRPR在AKI患者和模型中是否异常表达。
通过ELISA检测患者血清ProGRP，IHC/IF检测肾组织GRPR，RT-qPCR和Western blot检测小鼠模型（I/R和顺铂）中GRP和GRPR表达。
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遗传和药理学抑制GRPR通过减轻肾脏炎症和坏死性凋亡保护急性肾损伤
Genetic and pharmacological inhibition of GRPR protects against acute kidney injury via attenuating renal inflammation and necroptosis
实验完整度
高包含患者样本、多种小鼠模型（全局及条件性敲除、药物干预）、体外细胞实验及机制研究（RNA-seq、ChIP、Co-IP等），形成多层级验证。
主要模型
人肾小管上皮细胞系HK2 小鼠肾小管上皮细胞mTEC GRPR基因敲除小鼠（全局KO） GRPR条件性敲除小鼠（GRPRFlox/Flox/KspCre）
重点核对
GRPR表达水平：在患者和小鼠AKI模型中验证，尤其是在肾小管上皮细胞中。 GRPR敲除或过表达对肾损伤和炎症的影响：使用全局KO和条件性KO小鼠，以及细胞系。 STAT1信号通路：通过RNA-seq、Western blot、ChIP等验证STAT1在GRPR下游的作用。 GRPR拮抗剂RH-1402的疗效：在体内外模型中评估其预防和治疗效果。 TLR4与GRPR的相互作用：通过co-IP和IF验证。
摘要
胃泌素释放肽（GRP）与其受体（GRP受体[GRPR]）结合调节多种生物过程，但GRP/GRPR轴在急性肾损伤（AKI）中的功能仍不清楚。在本研究中，AKI患者或小鼠的肾小管上皮细胞（TECs）中GRPR高表达，而组蛋白去乙酰化酶8可能导致GRPR的转录激活。功能上，我们发现GRPR在AKI中具有致病性，因为GRPR基因缺失能够保护小鼠免受顺铂和缺血诱导的AKI。这一点通过GRPRFlox/Flox//KspCre小鼠中特异性删除TECs中的GRPR基因得到进一步证实。机制上，我们发现GRPR能够与Toll样受体4相互作用，激活STAT1，STAT1结合MLKL和CCL2的启动子，诱导TEC坏死性凋亡、坏死性炎症和巨噬细胞募集。这一点通过过表达STAT1恢复GRPRFlox/Flox/KspCre小鼠的肾损伤得到进一步证实。同时，STAT1诱导GRP合成，以加强GRP/GRPR/STAT1正反馈环路。重要的是，通过慢病毒包装的小发夹RNA靶向GRPR或使用新型GRPR拮抗剂RH-1402治疗能够抑制顺铂诱导的AKI。总之，GRPR在AKI中具有致病性，并通过STAT1依赖性机制介导AKI。因此，靶向GRPR可能是AKI的一种新型治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- GRP/GRPR轴在急性肾损伤中的功能作用及其潜在机制是什么？
- 核心机制
- GRPR通过与TLR4相互作用激活STAT1，STAT1结合MLKL和CCL2启动子诱导坏死性凋亡和炎症，并促进GRP自身合成形成正反馈，从而加重AKI。
- 主要证据
- 患者样本显示GRPR高表达；GRPR基因敲除（全局或肾小管特异性）在顺铂和缺血模型中保护肾功能；体外过表达或敲低GRPR影响损伤和炎症；STAT1过表达逆转保护作用。
- 研究意义
- 靶向GRPR可能是急性肾损伤的一种新型治疗策略，GRPR拮抗剂RH-1402显示出预防和治疗潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建基因敲除小鼠并评估肾损伤
通过遗传学手段验证GRPR在AKI中的功能。
利用GRPR全局KO和条件性KO（KspCre）小鼠，建立顺铂和I/R诱导的AKI模型，检测肾功能、肾小管损伤和炎症指标。
体外验证GRPR对TEC损伤和炎症的作用
在细胞水平证实GRPR对肾小管上皮细胞凋亡和炎症的影响。
在HK2和mTEC细胞中通过shRNA敲低或过表达GRPR，或使用CRISPR-Cas9敲除，用顺铂或H/R处理，检测KIM1、炎症因子和坏死性凋亡标志物。
揭示GRPR下游机制
阐明GRPR促进AKI的分子机制。
通过RNA-seq分析GRPR过表达mTEC的转录组，KEGG通路富集发现炎症和坏死性凋亡通路；验证GRPR与TLR4相互作用，STAT1磷酸化，STAT1结合MLKL和CCL2启动子，以及GRP的自分泌正反馈。
救援实验验证STAT1关键性
通过过表达STAT1验证其在GRPR介导的AKI中是否必要和充分。
在GRPR条件性KO小鼠和KO细胞中过表达STAT1，观察是否恢复肾损伤和炎症。
评估GRPR靶向治疗策略
探索抑制GRPR是否对AKI具有治疗作用。
使用慢病毒介导的GRPR敲低和GRPR拮抗剂RH-1402，在体内外模型中评估其预防和治疗效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | VivaCell | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 细胞处理 | 顺铂 | -- | -- |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | -- | -- | |
| 牛奶 | -- | -- | |
| 实时荧光定量PCR | Trizol试剂 | -- | -- |
| RealMasterMix逆转录试剂 | Toyobo | -- | |
| iQ SYBR Green supermix | Bio-Rad | -- | |
| 细胞活性检测 | MTT试剂 | -- | -- |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| 组织学检测 | PAS染色试剂盒 | -- | -- |
| 免疫组织化学 | DAB显色底物 | -- | -- |
| 细胞荧光 | DAPI | -- | -- |
| 免疫荧光 | 羊抗兔IgG-罗丹明 | Bioss | -- |
| FITC标记二抗 | -- | -- | |
| 免疫沉淀 | NP-40免疫沉淀缓冲液 | Sigma-Aldrich | -- |
| Protein G Sepharose 珠子 | -- | -- | |
| 染色质免疫沉淀 | SimpleChIP酶法染色质免疫沉淀试剂盒 | Cell Signaling Technology | -- |
| 荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶报告基因系统 | Promega | -- |
| 流式细胞术 | Annexin V-FITC | -- | -- |
| 碘化丙啶 | -- | -- | |
| RNA测序 | BGISEQ测序平台 | BGI | -- |
| 肾功能检测 | 肌酐检测试剂盒 | Nanjingjiancheng | -- |
| 尿素氮检测试剂盒 | Nanjingjiancheng | -- | |
| ProGRP检测 | GRP前体检测试剂盒 | Roche | -- |
| 放射配体结合实验 | 125I-Tyr4-BBN | PerkinElmer | NEX258 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型诱导 | 顺铂剂量：20 mg/kg；I/R缺血时间：40分钟；再灌注时间：24小时；小鼠品系、年龄、性别；对照组处理 阅读提示：Methods - Mouse models |
| 细胞处理 | 顺铂浓度：20 μmol/L；处理时间：24小时；H/R条件：0.1% O2 12小时，复氧时间；FBS浓度（饥饿时0.5%） 阅读提示：Methods - Cell culture and transfection |
| 基因敲除验证 | GRPR KO小鼠构建策略；条件性KO效率（约80%）；CRISPR sgRNA序列；Western blot验证抗体 阅读提示：Methods - Generation and verification of GRPR KO mice and conditional KO mice; Supplement Figure S2 |
| 药物处理 | RH-1402给药途径、剂量、时间点（预防实验在顺铂前，治疗实验在顺铂后1天）；细胞实验浓度（1-4 μmol/L） 阅读提示：Results - Treatment with a GRPR antagonist RH-1402; Figure 8 |
| 检测指标 | 血清肌酐和BUN测定；PAS染色评分标准；KIM1、TNF-α、IL-1β、CCL2检测方法；流式细胞术检测细胞死亡率；ChIP-qPCR引物序列 阅读提示：Methods and Figure legends |