鉴定circ-EIF6及其特征
筛选并验证在TNBC中差异表达的circRNA，并确认circ-EIF6的环状结构和稳定性。
通过RNA-seq分析2对转移和非转移乳腺癌组织以及MDA-MB-231与231_M细胞系，筛选出共同上调的circRNA，并通过qRT-PCR验证。利用RNase R处理、放线菌素D实验和qRT-PCR确认circ-EIF6的环状特性和稳定性，并通过Sanger测序验证其反向剪接。
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circ-EIF6编码EIF6-224aa，通过稳定MYH9并激活Wnt/beta-catenin通路促进三阴性乳腺癌进展
circ-EIF6 encodes EIF6-224aa to promote TNBC progression via stabilizing MYH9 and activating the Wnt/beta-catenin pathway
实验完整度
高包含体外细胞功能实验（敲低/过表达）、体内裸鼠移植瘤及肺转移模型、蛋白质互作与机制验证等独立证据层级。
主要模型
三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468 高转移亚系231_M BALB/c裸鼠移植瘤模型 临床TNBC组织样本
重点核对
circ-EIF6敲低/过表达对TNBC细胞增殖、迁移和侵袭的影响 EIF6-224aa过表达及ATG突变对细胞功能的作用 EIF6-224aa与MYH9的直接相互作用及MYH9降解的抑制 体内实验中circ-EIF6过表达对肿瘤生长和肺转移的影响 Wnt/beta-catenin通路激活及下游靶基因表达
摘要
环状RNA（circRNA）的蛋白质编码能力近来成为热点，但蛋白质编码circRNA在三阴性乳腺癌（TNBC）中的表达和作用仍不明确。通过交叉分析临床样本和细胞系的circRNA测序数据，我们鉴定了一个circRNA，命名为circ-EIF6，它在TNBC患者队列中预示较差的预后，并与临床病理特征相关。在功能上，我们证明circ-EIF6在体外和体内促进TNBC细胞的增殖和转移。在机制上，我们发现circ-EIF6包含一个675核苷酸（nt）的开放阅读框（ORF），并且ATG上游-150 bp的序列作为内部核糖体进入位点（IRES），这是5'帽非依赖编码RNA翻译起始所必需的。circ-EIF6编码一个新的肽段，命名为EIF6-224aa，它负责circ-EIF6的致癌效应。通过特异性抗体在TNBC细胞和组织中进一步检测了EIF6-224aa的内源性表达。此外，EIF6-224aa直接与MYH9相互作用，MYH9是乳腺癌中的一个癌基因，并通过抑制泛素-蛋白酶体途径减少MYH9降解，随后激活Wnt/beta-catenin通路。我们的研究为蛋白质编码circRNA的作用提供了新的见解，并支持circ-EIF6/EIF6-224aa作为TNBC患者个体化治疗的新型有前景的预后和治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 蛋白质编码circRNA在TNBC中的表达、功能及其分子机制尚不明确，本研究旨在鉴定功能性的蛋白质编码circRNA并阐明其作用机制。
- 核心机制
- circ-EIF6通过IRES依赖方式翻译编码新肽段EIF6-224aa，该肽段直接与MYH9蛋白相互作用，抑制其泛素-蛋白酶体降解，从而稳定MYH9并激活Wnt/beta-catenin通路，促进TNBC细胞的增殖和转移。
- 主要证据
- 体外敲低circ-EIF6抑制细胞增殖、迁移和侵袭；过表达EIF6-224aa促进细胞恶性表型，而ATG突变消除该效应；免疫共沉淀和质谱鉴定EIF6-224aa与MYH9结合；裸鼠实验显示circ-EIF6过表达促进肿瘤生长和肺转移。
- 研究意义
- 研究揭示了circ-EIF6/EIF6-224aa作为TNBC预后生物标志物和潜在治疗靶点的价值，为TNBC的靶向治疗提供了新思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
circ-EIF6功能缺失实验
评估敲低circ-EIF6对TNBC细胞增殖、迁移和侵袭的影响。
使用特异性siRNA敲低circ-EIF6，通过MTT、平板克隆、EdU、流式细胞周期、Transwell和 wound-healing实验检测细胞功能变化，并检测相关蛋白表达。
验证circ-EIF6编码EIF6-224aa
证明circ-EIF6能够通过IRES翻译产生EIF6-224aa肽段。
通过多聚体分析、双荧光素酶报告基因、RFP-GFP双顺反子报告载体和Western blot检测EIF6-224aa的表达；通过LC-MS鉴定肽段序列，并通过特异性抗体检测内源性表达。
EIF6-224aa功能获得和缺失实验
明确EIF6-224aa是circ-EIF6发挥致癌功能的主要效应分子。
在TNBC细胞中过表达circ-EIF6、circ-EIF6-ATG-mut、EIF6-224aa-FLAG或对照载体，检测增殖、迁移和侵袭能力；应用裸鼠移植瘤模型和肺转移模型验证体内效果。
机制验证：EIF6-224aa与MYH9互作及通路激活
阐明EIF6-224aa通过MYH9影响Wnt/beta-catenin通路的分子机制。
通过免疫共沉淀和质谱鉴定EIF6-224aa相互作用蛋白；通过共定位、截短体实验确定结合区域；通过CHX追踪和MG132处理检测MYH9蛋白稳定性；通过泛素化实验检测MYH9的泛素化水平；通过Western blot和qRT-PCR检测Wnt/beta-catenin通路相关蛋白和下游基因表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| circRNA测序 | RNA测序 | Cloud-Seq Biotech | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Invitrogen | -- |
| 胎牛血清 | HyClone | -- | |
| 载体构建 | circ-EIF6-FLAG-IRES缺失载体 | Vigene Biosciences | -- |
| circ-EIF6-ATG突变载体 | Vigene Biosciences | -- | |
| pcDNA3.1-RFP-GFP载体 | Vigene Biosciences | -- | |
| MYH9过表达载体 | Vigene Biosciences | -- | |
| MYH9截短体1载体 | Vigene Biosciences | -- | |
| MYH9截短体2载体 | Vigene Biosciences | -- | |
| MYH9截短体3载体 | Vigene Biosciences | -- | |
| MYH9截短体4载体 | Vigene Biosciences | -- | |
| 药物处理 | 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | -- |
| RNA处理 | RNase R | -- | -- |
| 细胞增殖检测 | MTT试剂 | -- | -- |
| EdU检测 | EdU增殖检测试剂盒 | RiboBio | -- |
| 细胞周期检测 | 碘化丙啶 | Beyotime | -- |
| 迁移/侵袭实验 | Transwell小室 | Corning Costar | -- |
| 侵袭实验 | Matrigel基质胶 | BD Biosciences | -- |
| FISH | 鲑鱼精DNA | Life Technologies | -- |
| 牛血清白蛋白 | Roche | -- | |
| ProLong Gold抗淬灭剂 | Life Technologies | -- | |
| 荧光标记的连接探针 | Generay | -- | |
| 多聚体分析 | TRIzol LS试剂 | -- | 15596026 |
| 荧光素酶报告 | 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Promega | -- |
| 蛋白质谱 | QExactive质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白免疫沉淀 | 蛋白A/G琼脂糖珠 | Life Technologies | -- |
| 泛素化实验 | MG132蛋白酶体抑制剂 | Selleck Chemicals | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| 逆转录 | PrimeScript逆转录试剂盒 | Takara | -- |
| qRT-PCR | SYBR Green PCR预混液 | Takara | -- |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | -- |
| 辣根过氧化物酶偶联二抗 | Millipore | -- | |
| Pro-lighting HRP检测试剂 | -- | -- | |
| 抗体生产 | EIF6-224aa抗体 | Abcepta | -- |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| circ-EIF6鉴定 | 样本类型和数量：2对转移和非转移乳腺癌组织；细胞系：MDA-MB-231、231_M、293T等；RNase R处理条件：3 U/μg，37°C 30分钟；放线菌素D浓度：2 μg/mL。 阅读提示：Materials and methods: circRNA sequencing, Actinomycin D and RNase R |
| 细胞功能实验 | 细胞系：MDA-MB-231和MDA-MB-468；siRNA转染序列和浓度；MTT实验时间点；Transwell实验细胞数（1×10^5）和接种条件。 阅读提示：Materials and methods: Cell proliferation assay, Migration and invasion assays, Figure 2 legends |
| circ-EIF6编码验证 | 多聚体分析中CHX浓度（100 μg/mL）和处理时间（15分钟）；双荧光素酶报告基因实验的转染试剂和检测条件；质谱分析的设备型号。 阅读提示：Materials and methods: Sucrose gradient fractionation assay, Luciferase reporter assay, LC-MS analysis, Figure 3 legends |
| 体内实验 | 小鼠品系：BALB/c nu/nu雌性；细胞接种数量：皮下1×10^7，尾静脉5×10^5；每组5只小鼠；肿瘤体积测量频率（每5天）和计算方式（1/2SW^2）。 阅读提示：Materials and methods: In vivo proliferation and metastasis assay, Figure 4 legends |
| 机制验证 | CHX浓度：20 μg/mL；MG132浓度：10 μM；处理时间：CHX 0、4、8、12小时，MG132 6小时；泛素化实验所用抗体和琼脂糖珠。 阅读提示：Materials and methods: CHX-chase assay, Ubiquitination assay, co-immunoprecipitation, Figure 5 legends |