样本与测序文库制备
从HG002细胞系提取DNA，构建多种测序平台的文库，以比较不同技术的性能。
使用Coriell细胞系GM24385提取DNA，分别制备Illumina、MGI、10X、ONT（R9/R10）和PacBio（Sequel/Revio）文库。
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测序技术的基准测试确定人类基因组遗传变异检测的最佳策略
Benchmarking of sequencing technologies defines optimal strategies for genetic variants detection in a human genome
实验完整度
高涵盖多种测序平台（SRS、LRS、10X）和多种变异检测流程，包含小变异与结构变异的基准测试、覆盖度梯度实验，并进行功能验证（变异检测准确性评估）。
主要模型
HG002（GM24385）细胞系（人类基因组DNA） PacBio Revio 与 Sequel II 长读长测序平台 ONT R9/R10 长读长测序平台 Illumina HiSeq X Ten 与 MGI G400 短读长测序平台
重点核对
参考基因组：GRCh37 decoy（hs37d5） 验证集：T2T v1.1 与 CMRG v1.0 测序平台与流程：SRS（Illumina、MGI）、LRS（PacBio、ONT）、10X 变异调用器：小变异（DRAGEN、DeepVariant等）与结构变异（SVIM、Sawfish等） 覆盖度梯度：SRS（2×-120×）、LRS（2×-60×）
摘要
背景 测序技术的进步不断提高人类遗传变异表征的分辨率和完整性。短读长测序因其高碱基准确性、通量和成本效益而仍被广泛使用；然而，其在解析重复和结构复杂区域方面的有限能力加速了长读长测序平台（包括 Pacific Biosciences (PacBio) 和 Oxford Nanopore Technologies (ONT)）的采用。结果 我们系统比较了测序技术和变异检测流程，涵盖不同基因组背景和测序深度下的小变异和结构变异。短读长测序结合 DRAGEN 在定位良好和中等复杂区域中对单核苷酸变异 (SNV) 和插入缺失 (indels) 实现了高准确性，但在结构变异检测方面显示出降低的敏感性和完整性。相比之下，长读长测序平台在检测结构变异和解析困难基因组区域中的小变异方面表现出明显优势，但在特定插入缺失易发序列背景下仍存在挑战。在长读长流程中，PacBio Revio 与 DeepVariant 在全基因组范围内实现了最高的 SNV 和插入缺失准确性，而 ONT R10 与 DeepVariant 在临床相关位点上表现尤为出色。结构变异检测由长读长优化的调用器主导，其中 SVIM 和 Sawfish 在 PacBio 上表现最佳，Sniffles2 和 CuteSV2 在 ONT 上表现最佳，在各种变异类别和大小上始终优于基于短读长的方法。覆盖度分析表明，长读长测序在 20× 到 45× 之间达到准确性饱和，而短读长测序需要超过 60× 的覆盖度才能接近最大基因组完整性。结论 这些结果为平台和流程选择提供了实用指导。长读长测序能够更全面地检测和解析结构变异及复杂基因组区域中的变异，而短读长测序仍然是高通量基因分型和临床重点应用的经济高效且可扩展的解决方案。补充信息 在线版本包含补充材料，可在 10.1186/s13059-026-04048-4 获取。关键词：第三代测序，Genome in a bottle，T2T，CMRG，变异检测，结构变异，LRS，SRS，Illumina，MGI，PacBio，Nanopore，WGS，人类参考基因组，ILMN，MGI，PB，ONT
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 系统比较不同测序技术和变异检测流程在不同基因组背景和测序深度下检测小变异（SNV/indel）和结构变异的准确性，以确定最佳策略。
- 核心机制
- 长读长测序通过跨越重复区域和减少比对歧义，提高了结构变异和复杂区域小变异的检测能力；短读长测序在简单区域和特定场景下仍具优势，但受限于读长和比对。
- 主要证据
- 基于HG002样本，结合T2T和CMRG基准集，评估了多种测序平台（Illumina、MGI、PacBio、ONT、10X）和多个变异调用器的F1分数、精确度和召回率，并通过覆盖度梯度分析确定饱和深度。
- 研究意义
- 为科研和临床应用中的测序平台和流程选择提供实用指导，强调长读长测序在全面发现和复杂区域解析中的优势，短读长测序在高通量基因分型和临床重点应用中的成本效益。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
测序数据生成
产生各平台的测序数据，用于变异检测性能评估。
在各自平台进行测序，获得原始测序数据（fastq/bam）。
数据比对与预处理
将读数比对到参考基因组，为变异检测做准备。
使用平台特定比对器（BWA-MEM、Minimap2、pbmm2等）将读数比对到GRCh37 decoy参考基因组，并进行标记重复和碱基质量校正。
小变异检测与评估
评估不同流程在SNV和indel检测上的准确性。
使用多种变异调用器（DRAGEN、DeepVariant、Clair3等）进行变异检测，并通过hap.py与T2T和CMRG基准集比较，计算F1分数、精确度和召回率。
结构变异检测与评估
评估不同流程在SV检测上的性能。
使用多个SV调用器（SVIM、Sawfish、Sniffles2等）进行SV检测，并通过truvari与T2T和CMRG基准集比较，计算discovery和genotyping F1。
覆盖度梯度分析
确定各平台达到性能饱和所需的最小测序深度。
将不同平台的数据下采样至多个覆盖度水平，重新进行变异检测和评估，绘制性能-覆盖度曲线。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
测序文库制备
基因组分层
覆盖度下采样
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI培养基 | ThermoFisher Scientific | -- |
| L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 胎牛血清 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| DNA提取 | SageHLS高分子量DNA文库系统 | Sage Science, Inc. | -- |
| DNA质量控制 | Qubit DNA高灵敏度检测 | ThermoFisher Scientific | -- |
| 文库制备 | Illumina TruSeq PCR-Free文库制备试剂盒 | Illumina | -- |
| Covaris LE220聚焦超声仪 | Covaris | -- | |
| Ampure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| 文库质量控制 | Agilent Bioanalyzer DNA高灵敏度检测 | Agilent Technologies | -- |
| KAPA qPCR文库定量试剂盒 | KAPA | -- | |
| 测序 | PhiX | Illumina | -- |
| 文库制备 | NxSeq AmpFREE低DNA文库试剂盒 | Lucigen | -- |
| COVARIS | Covaris | -- | |
| KAPA文库定量试剂盒 | Roche | -- | |
| LabChip GXII | PerkinElmer | -- | |
| MGIEasy通用文库转换试剂盒 | MGI | -- | |
| Qubit ssDNA检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 测序 | DNBSEQ-G400 | MGI | -- |
| DNA提取 | NEBNext dsDNA片段酶 | New England BioLabs | M0348 |
| Cas9核酸酶 | New England BioLabs | M0386 | |
| Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA | Integrated DNA Technologies, Inc. | -- | |
| DNA质量控制 | Qubit dsDNA BR检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific | Q32853 |
| Femto Pulse | Agilent Technologies, Inc. | FP-1002-0275 | |
| DNA提取 | Qiagen HMW DNA提取方案 | Qiagen | -- |
| MagAttract悬浮G | Qiagen | -- | |
| DNA质量控制 | NanoDrop 8000分光光度计 | ThermoFisher Scientific | -- |
| 文库制备 | 连接测序试剂盒 (SQK-LSK109) | Oxford Nanopore Technologies | -- |
| 测序 | FLO-PRO002 R9.4.1流动池 | Oxford Nanopore Technologies | -- |
| PromethIONBeta Release 19.05.1 | Oxford Nanopore Technologies | -- | |
| 碱基识别 | Guppy | Oxford Nanopore Technologies | -- |
| 测序 | MinION | Oxford Nanopore Technologies | -- |
| GridION | Oxford Nanopore Technologies | -- | |
| PromethION | Oxford Nanopore Technologies | -- | |
| DNA提取 | Qiagen MagAttract HMW DNA试剂盒 | Qiagen | -- |
| DNA剪切 | Megaruptor系统 | Diagenode | -- |
| DNA大小选择 | SRE XS 10 kb方案 | Circulomics | -- |
| 文库制备 | 连接测序试剂盒 SQK-LSK114 | Oxford Nanopore Technologies | -- |
| 测序 | FLO-PRO114M流动池 | Oxford Nanopore Technologies | -- |
| PromethION 48 | Oxford Nanopore Technologies | -- | |
| 测序控制 | MinKNOW | Oxford Nanopore Technologies | -- |
| 碱基识别 | Dorado | Oxford Nanopore Technologies | -- |
| DNA大小选择 | sageELF DNA大小选择系统 | SAGE Science | -- |
| 文库制备 | SMRTbell Prep Kit 3.0 | Pacific Biosciences | -- |
| DNA大小选择 | BluePippin系统 | Sage Science | -- |
| 0.75%琼脂糖凝胶卡夹 | Sage Science | -- | |
| Marker S1 | Sage Science | -- | |
| 测序 | PacBio Revio平台 | Pacific Biosciences | -- |
| 碱基识别 | SMRT Link | Pacific Biosciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本与细胞培养 | 细胞系：HG002（GM24385）来自Coriell Institute；培养基：RPMI，补充2 mM L-alanyl-L-glutamine，15% FBS，50 U/ml青霉素，50 µg/ml链霉素；培养条件：37°C，5% CO2；细胞密度：500,000 cells/ml，传代或收获时1 M cells/ml。 阅读提示：Materials and methods: Cell line culture |
| DNA提取与质量控制 | 使用SageHLS系统提取高分子量DNA；DNA质量评估（琼脂糖凝胶/Agilent Tapestation、Qubit HS、A260/280比值1.8-2.0）。 阅读提示：Materials and methods: DNA extraction, PCRfree-whole genome sequencing library preparation (Illumina) |
| 文库制备 | 不同平台文库制备试剂盒和输入量：Illumina TruSeq PCR-Free（500 ng）；MGI Lucigen NxSeq（1000 ng）；10X（SageHLS提取）；ONT连接测序（1.5 µg）；PacBio SMRTbell Prep Kit 3.0（5 µg）。 阅读提示：Materials and methods: PCRfree-whole genome sequencing library preparation (各平台) |
| 测序 | 测序平台和配置：Illumina HiSeq X Ten（2x150, 1 lane）；MGI DNBSEQ-G400（2x150）；ONT（MinION/GridION/PromethION，R9/R10）；PacBio（Sequel II/Revio）；10X（HiSeq X Ten）。 阅读提示：Materials and methods: Library preparation and sequencing |
| 数据比对 | 参考基因组：GRCh37 decoy（hs37d5）；比对器：BWA-MEM（SRS），Minimap2（ONT），pbmm2（PacBio）。 阅读提示：Materials and methods: Bioinformatics methods (Data processing) |
| 小变异检测 | 变异调用器：DRAGEN、DeepVariant、Clair3、GATK、Parabricks、MegaBOLT（SRS）；Clair3、DeepVariant、GATK、Nanocaller（LRS）；默认参数。 阅读提示：Materials and methods: Germline variant calling |
| 结构变异检测 | SV调用器：MetaSV、Dysgu、DRAGEN、CuteSV、Sniffles2、SVIM、pbsv、Sawfish；最小SV大小30 bp；参数设置（truvari等）。 阅读提示：Materials and methods: Structural variant detection, Structural variant benchmarking |
| 变异评估 | 评估工具：hap.py (v0.3.15) 用于小变异，truvari (v4.3.1) 用于SV；基准集：T2T v1.1 和 CMRG v1.0；性别参数（T2T中设置--gender male）。 阅读提示：Materials and methods: Germline variant assessment, Structural variant benchmarking |
| 覆盖度梯度分析 | 下采样工具：rasusa；覆盖度范围：SRS（2x-120x），LRS（2x-60x）；重新运行变异检测和评估。 阅读提示：Materials and methods: Downsampling, Results: Coverage titration |