构建等位基因特异性参考转录组
为每个样本创建包含母本和父本等位基因的参考转录本，以便对等位基因特异性表达进行定量。
使用g2gtools基于参考基因组、单核苷酸多态性（SNP）和插入缺失（indel）的VCF文件以及参考基因注释（GTF/GFF）构建二倍体转录组。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
SEESAW：考虑推断不确定性的异构体水平等位基因失衡检测
SEESAW: detecting isoform-level allelic imbalance accounting for inferential uncertainty
实验完整度
高包含模拟数据、小鼠成骨细胞分化时间序列数据，并采用多种方法进行实证评估和功能验证。
主要模型
果蝇（Drosophila melanogaster）模拟F1杂交 小鼠原代成骨细胞分化时间序列（C57BL/6J x CAST/EiJ F1）
重点核对
模拟数据：10个样本，平均测序深度5000万配对端读段，片段平均长度400bp，读段长度150bp。 模拟数据：1000个基因模拟等位基因失衡（500个一致性，500个不一致性），其余13,821个基因等位基因平衡。 小鼠数据：9个时间点（第2天至第18天），每次3个技术重复合并为一个生物学重复。 小鼠数据：使用pOBCol3.6GFPtpz转基因母鼠（C57BL/6J背景）与CAST/EiJ公鼠杂交获得F1后代。 统计检验：全局AI使用Wilcoxon符号秩检验，动态AI使用Pearson或Spearman相关检验，均基于30个bootstrap重复。
摘要
在异构体水平检测等位基因失衡需要考虑由RNA-seq读段多映射引起的推断不确定性。我们提出的方法SEESAW利用Salmon和Swish提供不同分辨率水平的分析，包括基因、异构体，以及通过转录起始位点将异构体聚集成组。这种聚合策略增强了对高不确定性转录本的信号。SEESAW方法套件在存在异构体水平等位基因失衡时，比其他等位基因失衡方法具有更高的功效。我们还引入了一种新的检验方法，用于检测随协变量（如时间）变化的失衡。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何开发一种在异构体水平检测等位基因失衡（AI）的方法，同时考虑RNA-seq读段多映射带来的推断不确定性，并能在不同分辨率（基因、异构体、TSS）下进行分析？
- 核心机制
- 通过将读段映射到等位基因特异性参考转录组，使用Salmon进行定量并估计推断不确定性；通过将异构体聚集成TSS组来增强信号并减少不确定性；使用非参数测试（Swish）进行AI检测，考虑推断不确定性。
- 主要证据
- 在模拟数据中，SEESAW在TSS水平对不一致AI的敏感性最高，FDR控制良好；在小鼠成骨细胞分化时间序列中，SEESAW识别出具有不一致AI的基因（如Fuca2、Sparc）和动态AI的基因（如Rasl11b、Calcoco1）。
- 研究意义
- SEESAW提供了一套统计检验工具，用于检测全局AI、动态AI和差异AI，有助于揭示顺式遗传调控在异构体水平的作用机制，为复杂性状和疾病的研究提供见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Salmon定量和推断不确定性估计
使用Salmon对二倍体转录组进行定量，并生成bootstrap重复以捕获推断不确定性。
使用Salmon（版本1.5.2）以--keepDuplicates和--numBootstraps 30参数对RNA-seq读段进行定量。
聚合等位基因计数到不同分辨率
将异构体水平的等位基因计数聚合到TSS组或基因水平，以增强信号并减少推断不确定性。
使用makeTx2Tss函数生成TSS组（可选择容差），使用importAllelicCounts导入估计计数、丰度和bootstrap重复，生成SummarizedExperiment对象。
全局AI检测
检测在所有样本中一致的等位基因失衡。
使用Swish的paired分析，设置x="allele", pair="sample"，采用Wilcoxon符号秩检验统计量，平均bootstrap重复，并通过置换计算q值。
动态AI检测
检测等位基因失衡随连续协变量（如时间）的变化。
使用Swish扩展功能，设置cov="day"，计算每个样本的对数等位基因折叠变化与协变量的Pearson或Spearman相关，并在bootstrap上平均，通过置换协变量计算q值。
模拟实验
评估SEESAW在不同AI类型和聚合水平下的敏感性和错误控制。
使用polyester模拟了来自果蝇二倍体转录组的RNA-seq读段，模拟了一致性AI和不一致性AI，并应用SEESAW（不同聚合水平）、mmseq/mmdiff和WASP进行比较，使用iCOBRA评估性能。
小鼠成骨细胞分化时间序列实验
在真实的F1小鼠时间序列数据中验证SEESAW的性能，检测全局和动态AI。
从C57BL/6J x CAST/EiJ F1小鼠新生颅骨中分离前成骨细胞，诱导分化，每2天收集RNA，使用SEESAW分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 构建参考转录组 | 参考基因组版本、SNP和indel VCF文件、基因注释文件 阅读提示：Methods: SEESAW部分，以及Osteoblast differentiation time course部分 |
| 定量 | Salmon版本、--keepDuplicates参数、--numBootstraps 30 阅读提示：Methods: SEESAW部分 |
| 聚合 | TSS分组容差（严格或模糊50bp）、最小计数过滤（10） 阅读提示：Methods: SEESAW部分 |
| 全局AI检测 | 配对分析参数（x="allele", pair="sample"）、bootstrap重复数（30） 阅读提示：Methods: SEESAW部分和Swish文档 |
| 动态AI检测 | 协变量（day）、相关方法（Pearson或Spearman）、伪计数默认值5 阅读提示：Methods: SEESAW部分 |
| 模拟实验 | 样本数（10）、测序深度（50M）、片段长度（400bp）、读段长度（150bp）、分散参数（size=100）、AI模拟方式（1000个基因，500一致性，500不一致性） 阅读提示：Methods: Simulation部分 |
| 小鼠成骨细胞实验 | 小鼠品系（B6xCAST）、时间点（9个）、分化诱导方法、RNA提取和测序 阅读提示：Methods: Osteoblast differentiation time course部分 |