比较不同Triton X100浓度裂解缓冲液
评估不同浓度的Triton X100对核糖体图谱和RNAseq中mRNA提取的影响。
使用含0.1%、0.5%和1% Triton X100的裂解缓冲液裂解HEK293T和Huh7细胞，分别进行核糖体图谱和RNAseq分析，比较差异基因表达和核糖体信号分布。
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常规细胞裂解程序扭曲核糖体图谱分析中的基因表达
Common cell lysis procedures distort ribosome profiling analyses of gene expression
实验完整度
高研究包含多层级证据：不同裂解缓冲液比较、离心前后RNAseq和核糖体图谱分析、Huh7细胞验证、数据质量评估及基因本体分析，并进行了功能验证（省略离心）。
主要模型
HEK293T细胞 Huh7细胞
重点核对
离心步骤是否省略（有/无10,000×g 5分钟离心） Triton X100浓度（0.1%、0.5%、1%） 细胞系（HEK293T、Huh7） 细胞培养条件（DMEM+10%FBS，37°C、5%CO2） 监测指标（mRNA丰度、核糖体图谱质量指标）
摘要
核糖体图谱分析是一种强大的技术，用于在全转录组范围内研究基因表达。它涉及对由核糖体保护的、免受核糖核酸酶消化的mRNA片段进行测序。初始步骤通常包括细胞裂解，然后进行离心和核糖核酸酶消化。我们发现离心会耗竭HEK293T细胞中329个翻译的mRNA。这些mRNA中有许多编码细胞骨架蛋白。这表明在大多数核糖体图谱分析实验中，一部分mRNA的表达可能被显著低估。我们表明，省略细胞裂解后的离心步骤可以解决这个问题。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 常规细胞裂解程序（包括离心澄清步骤）是否影响核糖体图谱分析中基因表达的准确性？
- 核心机制
- 编码细胞骨架蛋白的mRNA与细胞骨架成分结合，在裂解后离心时随碎片沉淀，导致这些转录本在标准核糖体图谱分析中被耗竭。
- 主要证据
- HEK293T细胞中，标准裂解缓冲液（1% Triton X100）与低浓度缓冲液（0.1%）比较，以及有/无离心步骤的核糖体图谱和RNAseq分析显示，省略离心可恢复329个mRNA的检测，这些mRNA富含肌动蛋白结合相关转录本；Huh7细胞中也观察到类似现象。
- 研究意义
- 研究提出省略离心澄清步骤可更准确量化蛋白质合成，并可能适用于多聚体测序（RNC-seq）等相关技术。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分析上清和沉淀中的mRNA分布
确定在标准离心条件下，哪些mRNA被沉淀到细胞碎片中。
对离心后的上清（可溶部分）和沉淀（不溶部分）分别提取RNA并进行RNAseq，比较两组mRNA丰度，并鉴定在沉淀中富含的转录本。
省略离心的核糖体图谱分析
测试省略离心步骤是否能恢复编码细胞骨架蛋白的mRNA的检测。
对HEK293T细胞裂解液进行或不进行离心处理，随后进行核糖体图谱分析，比较差异表达基因，并评估数据质量（如三联体周期性、读长分布、metagene图谱）。
基因本体论分析
确定受离心影响的mRNA的功能类别。
对差异表达基因进行GO分析，使用PANTHER数据库，鉴定富集的分子功能类别。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Sigma-Aldrich | -- |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞裂解 | Triton X100 | Sigma-Aldrich | -- |
| Turbo DNase | Invitrogen | -- | |
| RNA定量 | Qubit 4.0荧光计 | -- | -- |
| Qubit RNA宽范围检测试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA纯化 | RNA清洁和浓缩-5试剂盒 | Zymo Research | -- |
| RNA质量评估 | 2100生物分析仪 | Agilent | -- |
| RNA 6000 Nano检测试剂盒 | Agilent | -- | |
| 核糖体图谱分析 | RNase I | Biosearch Technologies | -- |
| T4多核苷酸激酶 | New England BioLabs | -- | |
| SUPERaseIn RNase抑制剂 | Invitrogen | -- | |
| Oligo清洁和浓缩试剂盒 | Zymo Research | -- | |
| ZR小RNA PAGE回收试剂盒 | Zymo Research | -- | |
| Dynabeads MyOne链霉亲和素C1 | Invitrogen | -- | |
| SMARTer smRNAseq试剂盒（Illumina） | Takara Bio | -- | |
| Select-a-Size DNA清洁浓缩试剂盒 | Zymo Research | -- | |
| 测序 | Illumina NovaSeq系统 | Illumina | -- |
| rRNA耗竭 | 生物素化扣除寡核苷酸 | -- | -- |
| 连接 | 预腺苷酸化DNA接头 | IDT | -- |
| 逆转录 | 逆转录引物 | IDT | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基，10%FBS，1mM L-谷氨酰胺，青霉素-链霉素，37°C，5% CO2，细胞约70%汇合度。 阅读提示：Methods: Ribosome profiling |
| 裂解和离心 | 裂解缓冲液成分（20mM Tris-Cl, 150mM NaCl, 5mM MgCl2, 1mM DTT, 0.1mg/ml CHX, 25U/ml Turbo DNase），Triton X100浓度（0.1%,0.5%,1%），是否离心（10,000×g,5min） 阅读提示：Methods: Ribosome profiling |
| 核糖体图谱分析 | RNase I消化（35U，23°C，1小时），RNA片段大小（28-30nt），rRNA耗竭寡核苷酸池，连接和逆转录条件。 阅读提示：Methods: Ribosome profiling |
| RNAseq库制备 | RNA提取（TRIzol），rRNA耗竭，测序平台和深度（150PE，2000万/样本）。 阅读提示：Methods: Ribosome profiling, Computational analysis |
| 数据分析 | 用于比较裂解缓冲液和离心条件的生物信息学流程，包括比对、UMI折叠、差异表达分析（DESeq2）和GO分析。 阅读提示：Methods: Computational analysis, Methods: Gene ontology analysis |