磷酸化蛋白质组学发现激活信号
鉴定FKH1细胞中异常激活的信号通路，生成假设。
对FKH1和U937细胞进行TMT标记定量磷酸化蛋白质组学分析，比较磷酸化肽段，并用STRING分析前40个上调蛋白的相互作用网络。
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t(6;9)-急性髓系白血病模型中信号通路的激活
Activation of signaling pathways in models of t(6;9)-acute myeloid leukemia
实验完整度
高包含体外细胞系模型（FKH1、U937等）、患者原代细胞、同基因小鼠白血病模型，并进行了磷酸化蛋白质组学、功能抑制实验及机制验证。
主要模型
FKH1细胞系（t(6;9)-AML） U937细胞系及其DEK-CAN稳定表达克隆 原代t(6;9)-AML患者白血病细胞 同基因DEK-CAN诱导的小鼠白血病细胞
重点核对
FKH1细胞中存在ETV6-ABL1融合，需通过RT-PCR和免疫印迹验证 用伊马替尼和达沙替尼抑制ABL1活性，验证其对FKH1生长的影响 用PP2抑制SFK，验证其对STAT5磷酸化及细胞增殖的影响 用Torin1、BEZ等抑制mTOR通路，验证其对FKH1和原代细胞的作用 实验所用抑制剂浓度及处理时间，如伊马替尼剂量递增曲线、PP2和达沙替尼的过夜处理
摘要
WHO亚组中的t(6;9)阳性急性髓系白血病（AML）患者与其他AML亚组不同，因为其特征是年龄较小和预后不良。白血病转化通常可归因于编码癌基因的单一染色体畸变，在t(6;9)-AML的情况下，即融合蛋白DEK-CAN（也称为DEK-NUP214）。作为一种罕见疾病，迫切需要t(6;9)-AML的模型。目前唯一可用的源自t(6;9)-AML患者的细胞系是FKH1。通过对FKH1细胞进行磷酸化蛋白质组学分析，我们发现了强烈激活的ABL1激酶。进一步研究揭示了ETV6-ABL1的存在。这一发现使得在使用FKH1时必须确定DEK-CAN和ETV6-ABL1相关的特征。这可以通过FKH1中ETV6-ABL1活性对伊马替尼的反应性来实现。然而，我们提供了证据表明FKH1中的SFK和mTOR激活是DEK-CAN相关的特征，因为它们在其他t(6;9)和DEK-CAN阳性模型中也被激活。先前显示在t(6;9)-AML中强烈激活且由DEK-CAN激活的STAT5的激活在FKH1中受DEK-CAN和ETV6-ABL1两者的调节。总之，FKH1细胞仍然代表t(6;9)-AML的模型，如果充分考虑这些白血病诱导癌基因的存在，也可以作为ETV6-ABL1阳性AML的模型。总之，我们的结果为白血病诱导癌基因和癌症信号通路之间的新的特定相互依赖性提供了明确证据，这将影响治疗策略的设计，以更好地解决癌症信号传导的复杂性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- t(6;9)-AML中是否存在由DEK-CAN驱动的激活信号通路网络，并确定各通路的调控机制及其作为治疗靶点的潜力。
- 核心机制
- 在FKH1细胞中，ABL1激酶激活由ETV6-ABL1融合驱动，而SFK和mTOR激活与DEK-CAN表达相关，STAT5激活受ETV6-ABL1和SFK共同调节，形成相互关联的信号网络。
- 主要证据
- 磷酸化蛋白质组学发现ABL1激活，RT-PCR证实ETV6-ABL1融合；免疫印迹和流式细胞术显示STAT5、SFK和mTOR的磷酸化状态；抑制实验表明这些通路对细胞生长的重要性。
- 研究意义
- 揭示DEK-CAN阳性AML中信号通路相互依赖的新机制，为设计针对多个信号节点的联合靶向治疗策略提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证ABL1活性及其机制
确认FKH1中ABL1激酶是否激活，并确定其激活原因。
通过免疫印迹和流式细胞术检测ABL1自磷酸化（Y412, Y245）和底物磷酸化（CRKL, STAT5）；使用RT-PCR检测ETV6-ABL1融合转录本；比较FKH1对伊马替尼和达沙替尼的敏感性。
解析STAT5调节机制
确定STAT5激活是否受ETV6-ABL1和SFK调节。
使用PP2（SFK抑制剂）和伊马替尼（ABL1抑制剂）单独或联合处理FKH1细胞，检测STAT5磷酸化水平；比较单独和联合抑制的效果。
评估SFK抑制对生长的影响
验证SFK活性是否对DEK-CAN阳性细胞生长至关重要。
用PP2、达沙替尼处理FKH1细胞、原代t(6;9)-AML原代细胞及同基因小鼠白血病细胞，进行XTT增殖实验和集落形成实验。
验证mTOR信号通路及治疗靶点潜力
确认DEK-CAN诱导mTOR激活，并评估mTOR抑制的效果。
在表达不同融合蛋白的U937细胞中检测mTOR通路激活；使用mTOR抑制剂处理FKH1和原代细胞，观察生长抑制。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
磷酸化蛋白质组学分析
蛋白表达和磷酸化检测
基因融合检测
统计和数据分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| X-Vivo10培养基 | Lonza | -- | |
| 人白细胞介素-3 | Miltenyi | -- | |
| 人干细胞因子 | Miltenyi | -- | |
| 人促血小板生成素 | Miltenyi | -- | |
| 人FLT3配体 | Miltenyi | -- | |
| 药物处理 | 伊马替尼 | Selleckchem | -- |
| 达沙替尼 | Selleckchem | -- | |
| PP2 | Selleckchem | -- | |
| 阿西米尼 | Selleckchem | -- | |
| GNF-2 | Selleckchem | -- | |
| Torin1 | Selleckchem | -- | |
| NVP-BEZ235 | Selleckchem | -- | |
| NVP-BKM120 | Selleckchem | -- | |
| AZD1208 | Selleckchem | -- | |
| 鲁索替尼 | Selleckchem | -- | |
| 渥曼青霉素 | Selleckchem | -- | |
| 免疫印迹 | mTor底物抗体套装 | Cell Signaling | -- |
| 磷酸化Akt通路抗体套装 | Cell Signaling | -- | |
| 抗磷酸化STAT5 (Y694)抗体 | Cell Signaling | -- | |
| 抗磷酸化ABL1 (Y245)抗体 | Cell Signaling | -- | |
| 抗磷酸化ABL1 (Y412)抗体 | Cell Signaling | -- | |
| 抗磷酸化SRC (Y416)抗体 | Cell Signaling | -- | |
| 抗SRC抗体 | Cell Signaling | -- | |
| 抗磷酸化LCK (Y505)抗体 | Cell Signaling | -- | |
| 抗ABL1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| 抗STAT5抗体 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| 抗磷酸化LYN (Y396)抗体 | Abcam | -- | |
| 抗LYN抗体 | BD Biosciences | -- | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Lab Vision | -- | |
| 5%脱脂奶粉 | Carl Roth | -- | |
| IRDye 800和680山羊抗兔或抗鼠二抗 | LI-COR Biosciences | -- | |
| Restore Western blot剥离缓冲液 | Perbio Science | -- | |
| LI-COR Odyssey Fc成像系统 | LI-COR Biosciences | -- | |
| 流式细胞术 | Cytofix固定缓冲液 | BD Biosciences | -- |
| 抗磷酸化STAT5 (Y694)抗体 (AlexaFluor 647) | BD Biosciences | -- | |
| 抗磷酸化AKT (S473)抗体 (PE-Vio770) | Miltenyi | -- | |
| 抗磷酸化CRKL (Y207)抗体 (APC) | Miltenyi | -- | |
| FACS Fortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 共聚焦显微镜 | 多聚-D-赖氨酸包被腔室玻片 | Corning | -- |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | -- | |
| Triton-X | -- | -- | |
| DAPI | Life Technologies | -- | |
| Moviol封片剂 | Sigma | -- | |
| Leica TCS-SP5共聚焦显微镜 | Leica Microsystems | -- | |
| 增殖检测 | XTT增殖试剂盒 | Roche | -- |
| 磷酸化蛋白质组学 | 胰蛋白酶 | -- | -- |
| TMT十标试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| SepPak柱 | Waters | -- | |
| 基于TiO2的磷酸化肽段富集试剂盒 | Pierce | -- | |
| Orbitrap Fusion Tribrid质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Acclaim PepMap C18纳升捕集柱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Acclaim PepMap C18反相分析柱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Xcalibur 2.0软件 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 数据分析 | Proteome Discoverer软件v2.1 | Thermo Scientific | -- |
| RStudio | -- | -- | |
| 集落形成实验 | MethoCult H4434半固体培养基 | Stem-Cell Technologies | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism9 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | FKH1细胞使用的培养基及血清浓度（20% FCS），是否添加G-CSF（原文提到失去因子依赖性，但培养条件未明确说明是否添加） 阅读提示：Materials and methods: Cell lines and cell culture |
| 磷酸化蛋白质组学 | 细胞密度（250,000 cells/ml），裂解后蛋白量（100 µg），TMT标记试剂盒，TiO2富集方法，质谱参数 阅读提示：Materials and methods: Phospho-proteomics |
| 药物处理 | 抑制剂浓度和处理时间：伊马替尼（0.5 µM），PP2（10 µM），达沙替尼（未明确浓度，但图4显示剂量曲线），过夜处理 阅读提示：Figure legends for Fig. 3 and Fig. 4 |
| 细胞增殖实验 | XTT实验处理时间（5天）及细胞数量 阅读提示：Materials and methods: Proliferation/cytotoxicity |
| 原代细胞培养 | 原代AML样本培养条件（X-Vivo10 + 10% FCS + 细胞因子），CFU实验半固体培养基及培养天数（10天或14天） 阅读提示：Materials and methods: Patient samples and CFU assays |