建立训练数据集
收集并构建用于训练和验证APPRAISE的AAV变体及其LY6A结合状态的数据集。
收集了肽展示AAV衣壳变体，根据其在不同小鼠品系中的脑转导特性推断其LY6A结合状态。
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通过结构建模快速准确地对工程蛋白的靶标结合倾向进行排序
Fast, accurate ranking of engineered proteins by target-binding propensity using structure modeling
实验完整度
高包含体外感染实验、体内小鼠实验、结构建模与评分、竞争性建模、相关性验证等多个证据层级，并进行功能验证。
主要模型
AAV9衣壳变体（如PHP.B, PHP.eB, PHP.D） HEK293T细胞 C57BL/6J小鼠 BALB/cJ小鼠
重点核对
LY6A受体依赖性比较：PHP.D与AAV9在C57BL/6J和BALB/cJ小鼠中的脑转导差异 感染剂量：体外5E8 vg/孔，体内3e11 vg/小鼠 检测时间：体外感染后24小时成像，体内3周后组织采集 对照：野生型AAV9，阴性对照PHP.C2
摘要
基于深度学习的蛋白质结构预测方法已达到前所未有的精度，但其在基于蛋白质的工程结合物中的应用仍受到限制，原因在于预测候选蛋白质结构的能力与根据潜在靶标结合能力对蛋白质进行优先排序的能力之间存在差距。为了弥合这一差距，我们引入了自动成对肽-受体分析筛选工程蛋白（APPRAISE），一种预测工程蛋白靶标结合倾向的方法。在使用既定的结构预测工具（如AlphaFold-Multimer或ESMFold）生成竞争性结合靶标的工程蛋白质结构模型后，APPRAISE执行快速（每个模型不到1 CPU秒）的评分分析，该分析考虑了生物物理和几何约束。作为概念验证案例，我们证明APPRAISE能够准确分类受体依赖性对受体非依赖性的腺相关病毒载体以及多种类别的工程蛋白，例如靶向严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）刺突的小蛋白、靶向G蛋白偶联受体的纳米抗体，以及特异性结合转铁蛋白受体或程序性死亡配体1（PD-L1）的肽。APPRAISE可通过使用Google Colaboratory的基于Web的笔记本界面访问（https://tiny.cc/APPRAISE）。凭借其准确性、可解释性和通用性，APPRAISE有望扩展蛋白质结构预测的实用性并加速用于生物医学应用的蛋白质工程。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何利用结构预测准确、高效地对工程蛋白的靶标结合倾向进行排序？
- 核心机制
- 通过竞争性建模和结合生物物理与几何约束的评分，将结合倾向的微小差异转化为可排序的信号。
- 主要证据
- 在AAV数据集上，APPRAISE 1.2的ROC AUC为0.838，AUPRC为0.845；在SARS-CoV-2小蛋白和纳米抗体数据集上，预测排名与实验排名显著相关（Spearman's ρ分别为0.88和0.89）。
- 研究意义
- APPRAISE提高了蛋白质结构预测在工程蛋白筛选中的实用性，可加速蛋白质治疗药物的开发。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
结构建模
生成候选蛋白与靶受体的复合物结构模型。
使用AF-Multimer或ESMFold对候选蛋白对与靶受体进行竞争性建模，生成结构模型。
计算结合分数
量化每个蛋白的结构模型中的结合能量和几何约束。
使用自定义PyMOL脚本测量接触原子数、冲突原子数、结合角度和结合深度，并根据公式（1）-（7）计算绝对和相对结合分数。
生成排序
根据分数矩阵对候选蛋白进行排序。
使用基于点的循环锦标赛系统，根据相对分数的统计显著性决定胜负，生成最终排序。
实验验证
验证APPRAISE预测的准确性。
对PHP.D进行体外感染和体内脑转导实验，确认其LY6A依赖性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
体外功能验证
体内功能验证
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 结构建模 | AlphaFold-Multimer | -- | -- |
| ESMFold | -- | -- | |
| ColabFold | -- | -- | |
| V100 SXM2 16GB GPU | NVIDIA | -- | |
| A100 SXM4 40GB GPU | NVIDIA | -- | |
| 结构分析 | PyMOL 2.3.3 | Schrödinger | -- |
| HullRad v8.1 | -- | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 非必需氨基酸 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| FluoroBrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| HEPES | -- | 7365-45-9 | |
| 体外感染试验 | NucBlue Live ReadyProbes试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Keyence BZ-X700 | Keyence | -- | |
| 体内小鼠实验 | Leica VT1000S | Leica | -- |
| Zeiss LSM 880共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| Zen Black 2.3 SP1 | Zeiss | -- | |
| 细胞培养 | HEK293T细胞 | ATCC | CRL-3216 |
| 体内小鼠实验 | C57BL/6J小鼠 | The Jackson Laboratory | 000664 |
| BALB/cJ小鼠 | The Jackson Laboratory | 000651 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 结构建模 | 结构预测工具（AF-Multimer或ESMFold）及其设置，如msa_mode、num_models、num_recycles、是否使用模板等 阅读提示：Materials and methods, Structure modeling |
| 结合评分分析 | 接触原子距离阈值（5 Å）、冲突原子距离阈值（1 Å）、角度约束函数（公式6）和深度约束函数（公式7）的参数 阅读提示：Materials and methods, Physics-informed analysis |
| 体外感染试验 | HEK293T细胞培养条件，LY6A转染剂量（2.53 μg质粒），AAV感染剂量（5e8 vg/孔），成像时间（24小时） 阅读提示：Materials and methods, In vitro infectivity assay |
| 体内小鼠实验 | 小鼠品系、年龄、注射途径（眶后）、注射剂量（3e11 vg/小鼠）、组织采集时间（3周） 阅读提示：Materials and methods, In vivo mouse experiment |