Nanofitin的筛选与表征
从核糖体展示文库中筛选针对SARS-CoV-2刺突蛋白S1亚基的Nanofitin，并评估其结合和中和活性。
通过四轮核糖体展示选择，共分离95个克隆，筛选出31个独特Nanofitin，鉴定出NF1-NF4候选物。ELISA测定EC50和IC50，BLI测定亲和力。
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可吸入Nanofitin通过直接应用于呼吸道展现对SARS-CoV-2病毒的高效中和作用
Inhalable Nanofitin demonstrates high neutralization of SARS-CoV-2 virus via direct application in respiratory tract
实验完整度
高包含体外结合、中和实验，体内小鼠模型验证，以及雾化稳定性、分布研究，多层级验证。
主要模型
HEK293T ACE2/TMPRSS2细胞 A549人肺癌细胞系（稳定表达人ACE2） huK18ACE2小鼠（SARS-CoV-2感染模型） C57BL/6小鼠（药物分布和安全性评估）
重点核对
Nanofitin四聚体的构建（NF1、NF2、NF3、NF4融合） 体外中和活性（假病毒和活病毒） 雾化稳定性（1 mg/mL和8 mg/mL，Aeroneb solo雾化器） 体内药效（预防和治疗方案，10 mg/kg剂量） 肺部分布（气管内给药10 mg/kg）
摘要
Nanofitin是小型且超热稳定的替代蛋白支架，具有适合开发局部治疗药物的理化特性，特别是用于治疗肺部感染性疾病。生物制剂经肺部局部给药涉及雾化这一特别有压力的步骤，而大多数抗体对雾化耐受性差，这限制了它们通过该递送途径的应用。在COVID-19大流行期间，我们生成了对刺突蛋白具有高特异性的抗SARS-CoV-2单体Nanofitin。根据与点突变刺突蛋白的结合特性，鉴定了命中Nanofitin候选物，并将其组装成由四种不同Nanofitin组成的线性多聚体构建体，从而生成高效抗SARS-CoV-2分子。多聚体的治疗效果已在体外和体内模型中得以证明。有趣的是，多聚体构建体的中和机制似乎涉及刺突三聚体的特定构象转换。此外，我们报道了四聚体构建体在雾化后的稳定性和活性保持。这一有利于肺部给药的开发特性，加上组装的简便性以及快速的生成过程，使Nanofitin技术成为应对新发传染病的潜在治疗解决方案。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 研究旨在评估Nanofitin支架技术是否能够开发出可吸入的SARS-CoV-2局部治疗药物，并解决抗体雾化不稳定的问题。
- 核心机制
- 四聚体Nanofitin通过靶向刺突蛋白的RBD和非RBD表位，诱导刺突三聚体构象改变（从全RBD向下转为两个RBD向上），并通过夹钳机制锁定第三个RBD向下，从而阻止病毒与ACE2结合，中和病毒感染。
- 主要证据
- 体外假病毒中和实验显示四聚体IC50为61 pM（与casirivimab相当）；体内huK18ACE2小鼠模型中，预防性和治疗性给药均显著降低肺病毒载量，且在TCID50检测中达到不可检测水平。
- 研究意义
- 作者提出Nanofitin技术平台可用于快速开发针对新发传染病的可吸入治疗药物，通过局部给药提高药物在肺部的浓度，并可能减少全身暴露。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
四聚体Nanofitin的构建与体外活性评估
通过基因融合构建多聚体Nanofitin，增强亲和力和中和效力，并测试对不同假病毒的中和能力。
将NF1、NF2、NF3和NF4依次融合，构建四聚体。使用假病毒中和实验评估活性，并比较与单体和casirivimab的效果。
结构机制研究：负染色电镜
观察单体及四聚体Nanofitin与刺突三聚体的结合，探究构象变化机制。
负染色电镜观察Nanofitin与刺突三聚体的复合物，分析构象分布。
雾化稳定性评估
评估四聚体Nanofitin在雾化过程中的物理稳定性和生物活性保持。
使用Aeroneb solo雾化器对浓度为1 mg/mL和8 mg/mL的四聚体进行雾化，测定回收率、聚集、粒径和结合活性。
体内分布和安全性评估
评估四聚体Nanofitin经气管给药后在肺部的分布和局部耐受性。
对C57BL/6小鼠气管内给予10 mg/kg Nanofitin，于2、6、24小时取肺组织进行免疫荧光检测，并分析BALF中细胞组成。
体内药效学评估（预防和治疗）
在huK18ACE2小鼠模型中评估四聚体Nanofitin预防和治疗SARS-CoV-2感染的效果。
小鼠经鼻内感染SARS-CoV-2，以预防或治疗方案给予Nanofitin，于第5天检测肺病毒载量和组织病理。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白筛选 | SARS-CoV-2刺突蛋白 | Sino Biological Inc. | -- |
| ELISA | RGS-His辣根过氧化物酶偶联抗体 | Qiagen | -- |
| TMB | Merck | -- | |
| Varioskan酶标仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 竞争性ELISA | 人ACE2重组蛋白 | Sino Biological Inc. | -- |
| SARS-CoV-2刺突S1-Fc重组蛋白 | Sino Biological Inc. | -- | |
| 过氧化物酶标记亲和纯化驴抗人IgG Fc片段 | -- | -- | |
| BLI分析 | Octet RED96系统 | Sartorius | -- |
| 蛋白A生物传感器 | Sartorius | -- | |
| 负染色电镜 | 重组刺突三聚体 | ACROBiosystems | -- |
| 细胞培养 | HEK293T ACE2/TMPRSS2细胞 | Virongy Biosciences Inc. | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| Glutamax | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 假病毒中和试验 | SARS-CoV-2刺突D614G假病毒 | BPS Bioscience | -- |
| 一步法荧光素酶试剂 | BPS Bioscience | -- | |
| Glomax生物发光检测仪 | Promega | -- | |
| 病毒中和试验 | Luna通用一步法RT-qPCR试剂盒 | New England Biolabs | -- |
| Applied Biosystems QuantStudio 7热循环仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 瑞德西韦 | -- | -- | |
| 雾化实验 | Aeroneb solo振动筛网雾化器 | Aerogen | -- |
| Spraytec激光衍射粒度仪 | Malvern Panalytical | -- | |
| FC200-IPAC流式细胞仪 | Occhio | -- | |
| DynaPro NanoStar动态光散射仪 | Wyatt Technology | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| SEC-UPLC | Acquity UPLC BEH SEC色谱柱125 Å，1.7 μM，4.6 mm × 150 mm | Waters Corporation | -- |
| 免疫组化 | HA标签抗体（C29F4） | Cell Signaling Technology | -- |
| 抗兔PE标记驴IgG | Biolegend | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Nanofitin生成 | 核糖体展示筛选轮数、文库类型 阅读提示：Materials and methods, Nanofitin generation |
| 多聚体构建 | 载体、限制性位点、连接肽长度 阅读提示：Materials and methods, Multimeric construct |
| 体外功能验证 | 细胞系、假病毒类型、MOI、孵育时间、检测方法 阅读提示：Materials and methods, Lentivirus neutralization assay and SARS-CoV-2 virus neutralization assay |
| 雾化稳定性评估 | 雾化器型号、浓度、缓冲液、检测指标 阅读提示：Materials and methods, Nebulization assay |
| 体内分布和药效 | 小鼠品系、感染剂量、给药途径、给药方案、剂量、检测时间点 阅读提示：Materials and methods, Pharmacokinetics assay and In vivo efficacy |