验证IFN-γ启动子的反应性和调控动力学
确定IFN-γ启动子是否对TCR信号快速响应并可逆关闭，以及是否适合作为可诱导启动子。
用CD3/CD28 Dynabeads刺激人T细胞，在不同时间点检测胞内IFN-γ积累；去除刺激后检测IFN-γ关闭动力学。
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利用内源性IFN-γ启动子构建新型TRUCK实现细胞因子表达
Building a novel TRUCK by harnessing the endogenous IFN-gamma promoter for cytokine expression
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内异种移植瘤模型、基因编辑效率验证、功能杀伤实验及机制验证，证据层级丰富。
主要模型
HGC-27胃癌细胞系 NCG小鼠异种移植瘤模型 人原代T细胞
重点核对
IFN-γ启动子的激活动力学（刺激后1小时内蛋白质积累） 3'UTR敲入不干扰内源IFN-γ表达（ELISA和胞内染色） IL-15表达的抗原依赖性（CD3/28刺激后检测） 双敲入效率（AZD7648处理后约30%的双阳性比例） 体内抗肿瘤效果（肿瘤体积和生存期）
摘要
尽管嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中取得了显著成功，但其在实体瘤中的疗效仍然有限。细胞因子工程化的CAR T细胞提供了一条有前景的途径，但其临床转化受到组成型细胞因子表达相关风险的阻碍。在这项概念验证研究中，我们利用内源性干扰素（IFN）-γ启动子进行转基因白细胞介素（IL）-15的表达。我们证明了IFN-γ的表达受到T细胞受体信号传导的严格调控。通过同源定向修复介导的敲入，将内部核糖体进入位点IL15引入IFN-γ基因的3'UTR，我们证实IL-15的表达可以与IFN-γ以抗原刺激依赖的方式共表达。重要的是，转基因的插入不会损害内源性IFN-γ的表达。体外和体内数据表明，由IFN-γ启动子驱动的IL-15显著提高了CAR T细胞的抗肿瘤活性，表明IL-15表达的有效性。最后，作为我们临床转化努力的一部分，我们开发了一种创新的双基因敲入方法。该方法能够使用单个AAV载体同时将CAR和IL-15基因整合到TRAC和IFN-γ基因位点。使用这种方法工程化表达IL-15的CAR T细胞表现出增强的抗肿瘤功效。总之，我们的研究强调了在CAR T细胞中利用内源性启动子进行转基因细胞因子表达的可行性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否利用内源性IFN-γ启动子驱动转基因细胞因子（IL-15）在CAR T细胞中表达，并增强其抗肿瘤活性？
- 核心机制
- IFN-γ启动子受TCR信号严格调控，通过HDR敲入IRES-IL15至IFN-γ 3'UTR，实现IL-15与IFN-γ共表达，且不影响内源IFN-γ表达；IL-15的抗原依赖性表达增强CAR T细胞的多功能性和抗肿瘤活性。
- 主要证据
- 体外反复刺激杀伤实验显示CAR-IL15GFP组在第四轮杀伤中活性增强，细胞因子（IFN-γ、IL-2、TNF-α）分泌增加，CD62L+CD45RA+干细胞记忆/初始样T细胞比例升高；体内异种移植瘤模型中，CAR-IL15GFP组肿瘤消除或生长延缓。
- 研究意义
- 该策略提供了一种更安全有效的TRUCK构建方法，可扩展到利用其他内源启动子或表达其他细胞因子，为临床转化奠定基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
筛选靶向IFN-γ 3'UTR的gRNA并评估敲入效率
筛选高效且不影响IFN-γ表达的gRNA用于HDR敲入。
设计4条gRNA，通过电穿孔导入Cas9 RNP，检测插入缺失效率，并评估对IFN-γ表达的影响；随后用PCR或AAV递送供体模板评估敲入效率。
构建GFP和IL-15敲入细胞并验证表达特性
验证IRES介导的转基因表达是否与内源IFN-γ共表达，且不影响IFN-γ表达。
将IRES-GFP或IRES-IL15-2A-GFP插入IFN-γ 3'UTR，刺激后检测GFP、IL-15和IFN-γ表达。
制造CLDN18.2 CAR T细胞并验证IL-15表达
验证在CAR T细胞中，IFN-γ启动子驱动的IL-15表达不影响CAR转导和基因编辑效率。
激活人T细胞后转导CLDN18.2 CAR慢病毒，随后进行RNP电穿孔和AAV转导，检测CAR表达、敲入效率及IL-15分泌。
评估IL-15对CAR T细胞抗肿瘤活性的影响（体外）
验证IFN-γ启动子驱动的IL-15是否能增强CAR T细胞的杀伤能力和多功能性。
进行反复刺激杀伤实验，共培养CAR T细胞与HGC-27-035细胞，后检测杀伤率、细胞因子分泌和T细胞表型。
评估IL-15对CAR T细胞抗肿瘤活性的影响（体内）
在异种移植瘤模型中验证IL-15驱动的CAR T细胞的抗肿瘤效果。
皮下接种HGC-27-035细胞，7天后静脉注射CAR T细胞，监测肿瘤体积和生存期。
开发CAR和IL-15双敲入策略
简化制造流程，使用单个AAV载体同时敲入CAR和IL-15。
设计含有TRAC位点CAR敲入和IFN-γ位点IL-15敲入的AAV载体，同时进行双gRNA编辑，并用AZD7648提高敲入效率，验证染色体易位情况。
验证双敲入CAR T细胞的抗肿瘤活性
评估双敲入策略下IL-15表达对CAR T细胞抗肿瘤活性的影响。
制造DKI-GFP和DKI-IL15 CAR T细胞，进行体外反复杀伤实验和体内异种移植瘤模型实验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Sigma-Aldrich | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| T细胞培养 | X-VIVO 15无血清培养基 | Lonza | -- |
| AB型血清 | GemCell | -- | |
| 重组人IL-2 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| T细胞激活 | CD3/CD28磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 基因编辑 | TrueCut Cas9蛋白 | Invitrogen | -- |
| 多聚谷氨酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| AZD7648 | Selleck Chemicals | -- | |
| 慢病毒包装 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 流式细胞术 | Golgi Plug（布雷菲德菌素A） | BD Biosciences | -- |
| Golgi Stop（莫能菌素） | BD Biosciences | -- | |
| Cytofix/Cytoperm固定透化试剂 | eBioscience | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | -- | |
| APC标记抗人IFN-γ抗体 | BioLegend | -- | |
| APC标记小鼠IgG1 κ同型对照抗体 | BioLegend | -- | |
| APC标记抗人CD3抗体 | BioLegend | -- | |
| PE标记抗人CD45抗体 | BioLegend | -- | |
| PE标记抗人CD279抗体 | BioLegend | -- | |
| Hu/NHP CD69 PerCP-Cy5.5抗体 | BioLegend | -- | |
| APC-H7标记抗人CD45RA抗体 | BD Biosciences | -- | |
| PE标记抗人CD62L抗体 | BD Biosciences | -- | |
| APC-Cy7标记抗人CD8抗体 | BD Biosciences | -- | |
| CD4 PerCP-Cy5.5抗体 | BD Biosciences | -- | |
| APC链霉亲和素 | BioLegend | -- | |
| 抗G4S连接肽单克隆抗体 | Hycells | -- | |
| 实时细胞毒性分析 | xCELLigence RTCA系统 | Acea Biosciences | -- |
| 细胞因子检测 | Bio-Plex Pro试剂盒 | Bio-Rad Laboratories | -- |
| DNA提取 | Agencourt chloropure | Beckman Coulter | -- |
| 基因组分析 | Bioruptor Pico超声破碎仪 | Diagenode | -- |
| 测序 | MGI 2000测序平台 | -- | -- |
| 细胞分选 | 细胞分选仪 | Sony Corporation | -- |
| 电穿孔 | Lonza 4D核转染仪 | Lonza | -- |
| 小型设备 | 0.45微米滤膜 | -- | -- |
| 病毒浓缩 | 100 kDa离心过滤装置 | Millipore | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| T细胞激活与培养 | CD3/CD28 Dynabeads与细胞的比例为3:1；培养用X-VIVO 15培养基补充5% AB血清和300 U/mL IL-2。 阅读提示：见Materials and methods“Generation of CAR T cells”部分 |
| 基因编辑敲入 | 电穿孔方案：RNP包含100 pmol Cas9蛋白、8 μg gRNA和80 μg PGA，脉冲代码EH-115或T cell human stim；AAV递送供体模板；双敲入时添加3 μM AZD7648。 阅读提示：见Materials and methods“Gene editing of CAR T cells”和“Double knock-in strategy”部分 |
| 体外杀伤实验 | E:T比例为0.5:1，靶细胞为HGC-27-035（表达CLDN18.2）或HGC-27-180（表达Nectin4），反复刺激4轮，每轮48小时；检测使用xCELLigence RTCA。 阅读提示：见Materials and methods“Real-time cytotoxicity assay”部分及Figure 5 legend |
| 细胞因子检测 | 使用ELISA（商品化试剂盒）检测IFN-γ、IL-15、TNF-α、IL-2；具体试剂盒信息见Bio-Plex Pro Reagent Kit。 阅读提示：见Materials and methods“Cytokines release assay”部分 |
| 体内异种移植瘤模型 | NCG小鼠（6周龄雌性，SPF级），皮下接种5×10^6个肿瘤细胞，7天后静脉注射5×10^6个CAR T细胞；监测肿瘤体积和体重。 阅读提示：见Materials and methods“In vivo experiments”部分及Figure 5和Figure 6 legend |
| 双敲入验证 | CAR敲入效率约60%；双敲入效率约30%（AZD7648处理后）；染色体易位检测使用PCR和PEM-seq（最终产物中未检测到易位）。 阅读提示：见Materials and methods“Detection of chromosomal translocation”部分及Figure S2 |