靶向聚合酶链反应在疑似早发型脓毒症中的检出率:一项针对血培养阴性的足月及近足月新生儿的前瞻性队列研究

Yield of Targeted Polymerase Chain Reaction in Probable Early-Onset Sepsis: A Prospective Cohort Study in Term and Near-Term Neonates With Negative Blood Culture Results

作者信息Fleur M Keij, Corné H W Klaassen, René F Kornelisse, Mireille van Westreenen, Gerdien A Tramper-Stranders
PMID39660017
发布时间2024-11-19
DOI10.1093/ofid/ofae681

实验完整度

中

研究包含临床队列样本(284例新生儿血培养残留物)和实验室验证(PCR开发、阳性对照、加标实验),但缺乏功能或机制验证。

主要模型

疑似细菌感染的足月及近足月新生儿队列 血培养残留物

重点核对

284名新生儿血培养样本,培养5天后储存于-80°C 针对GBS和E.coli的靶向PCR,三重复检测 Ct值<37定义为阳性 样本处理:血清分离管、MagNA Pure 96 DNA提取 统计分析:3组间比较,P<.05为显著

摘要

背景 区分非感染与感染的新生儿病例仍然具有挑战性,因此许多新生儿在出生后第一周内接受抗生素治疗。我们旨在研究针对B族链球菌(GBS)和大肠杆菌的靶向聚合酶链反应(PCR)对足月及近足月疑似早发型脓毒症(EOS)新生儿剩余血培养培养基的附加价值。 方法 参与RAIN研究的新生儿的剩余血培养材料在培养5天后储存。RAIN研究评估了在疑似细菌感染(定义为有危险因素和/或临床体征且炎症参数升高但血培养结果为阴性)中静脉-口服抗生素转换治疗。我们对EOS的主要病原体GBS和大肠杆菌应用了2种靶向PCR,并批量地对每种PCR进行三次重复分析。 结果 对284名新生儿的血培养培养基进行了三次重复PCR检测。在23名新生儿中,PCR结果呈阳性(3个循环阈值<37),其中GBS(n=1)或大肠杆菌(n=22)。炎症参数不能区分PCR阳性结果,脓毒症的危险因素如母亲GBS状态和胎膜早破也不能区分。然而,PCR阳性新生儿中96%为阴道分娩,而PCR阴性组为74%(P=.05);此外,96% vs 81%(P=.21)的新生儿有临床症状。 结论 血培养阴性的新生儿“疑似”EOS伴随8%的PCR阳性率,提示出生后低水平菌血症但临床后果尚不清楚。进一步研究应聚焦于PCR如何有助于新生儿更针对性地使用抗生素,特别是在高度怀疑感染但血培养结果阴性的情况下。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
在血培养阴性的疑似EOS新生儿中,使用针对GBS和E.coli的靶向PCR是否能检测到病原体,其检出率及临床意义如何?
核心机制
低水平菌血症或细菌DNA的存在,可能源于分娩时母体菌群的围产期传播,尤其是在阴道分娩的新生儿中。
主要证据
在284例血培养阴性新生儿中,8.1%的病例靶向PCR结果确定阳性(23例,22例E.coli,1例GBS);PCR阳性组中阴道分娩比例显著高于阴性组(96% vs 74%,P=.05)。
研究意义
研究提示PCR可能有助于指导疑似EOS新生儿的抗生素治疗,减少不必要的抗生素暴露,但其临床意义及低水平菌血症的作用需进一步研究。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

队列建立与样本收集

收集疑似细菌感染且血培养阴性的足月及近足月新生儿的血培养残留物,用于后续PCR检测。

从RAIN研究的510名新生儿中纳入284名,收集血培养阴性且培养5天后的残留物(2×2 mL血与培养基混合),储存于-80°C。同时收集5份阳性对照血培养物。

2

靶向PCR的开发与优化

建立针对GBS和E.coli的灵敏且特异的实时PCR检测方法,用于检测血培养残留物中的细菌DNA。

基于已有方法(E.coli PCR参考Pavlovic et al.)和新建GBS PCR(靶向dltS基因),优化引物探针浓度,检测限接近1个细胞当量DNA。样本经血清分离管处理,提取DNA后,在LightCycler 480上进行PCR。

3

PCR检测与结果分类

对284例新生儿血培养残留物进行GBS和E.coli靶向PCR检测,并根据Ct值将结果分为阴性、可能阳性、确定阳性。

对所有样本分批进行三重复PCR检测,记录Ct值,根据预设标准分类。

4

临床与实验室指标分析

比较PCR阳性、可能阳性、阴性三组新生儿的基线特征和感染相关指标,以评估PCR结果是否与临床特征相关。

收集基线和感染相关数据(如分娩方式、母亲GBS状态、C反应蛋白、降钙素原等),并进行组间比较。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

样本处理与核酸提取

产品清单

实验环节名称品牌货号
血清分离管Becton Dickinson--
MagNA Pure 96Roche Diagnostics--
MagNA Pure 96 DNA和病毒NA小体积试剂盒Roche Diagnostics--
LightCycler 480Roche Diagnostics--
LightCycler 480探针法预混液Roche Diagnostics--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
样本收集与储存
血培养的体积和采集时机;培养5天后储存于-80°C的条件;血培养瓶品牌
阅读提示:Methods 部分
PCR检测
PCR引物和探针序列(补充表1);循环条件;Ct值阈值37;三重复检测;阳性对照
阅读提示:Methods 部分和 Supplementary Table 1
数据分析
分组标准(确定阳性、可能阳性、阴性);统计检验方法
阅读提示:Methods 部分