Prime editing efficiently generates W542L and S621I double mutations in two ALS genes in maize
包含载体构建、玉米稳定转化、直接测序、克隆测序、NGS等多个独立验证层级，并进行了功能验证（除草剂抗性相关突变）和机制验证（pegRNA表达策略比较）。
玉米自交系ND73（B73衍生系） 水稻原生质体瞬时表达系统
玉米转化使用农杆菌菌株LBA4404/pVS1-VIR2（三元载体系统） 转化受体为玉米自交系ND73 通过直接测序、克隆测序和NGS（Hi-TOM，阈值0.5%）检测突变 水稻原生质体转染采用PEG介导方法，孵育条件为26°C，48小时
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建用于产生P165S或W542L/S621I突变的先导编辑载体，并比较不同pegRNA表达增强策略
利用分子克隆技术构建了多种先导编辑载体：pZ1PE3和pZ1PE3b用于P165S突变；pZ1WS和pZ1WS-Csy4用于W542L/S621I双突变；p4xZ1PE3-Csy4和p4xZ1PE3b-Csy4作为对照。增强表达策略包括加倍pegRNA表达盒数量、使用双启动子系统（聚合酶II的35S增强子-CmYLCV和聚合酶III的缩短U6-26）驱动pegRNA表达，以及使用tRNA、核酶和Csy4 RNA加工系统。
将先导编辑载体导入玉米基因组，产生转基因植株
将六个PE载体（pZ1PE3, pZ1PE3b, p4xZ1PE3-Csy4, p4xZ1PE3b-Csy4, pZ1WS-Csy4, pZ1WS）分别转化为农杆菌菌株LBA4404/pVS1-VIR2，然后用这些菌株转化玉米自交系ND73，按已发表的方案进行。
检测转基因植株中目标位点的突变，评估先导编辑效率
从转基因植株基因组DNA中PCR扩增目标片段，进行直接测序、克隆测序和NGS（Hi-TOM，阈值0.5%）分析。统计携带目标突变的植株比例，并分析副产物类型和频率。
验证两种增强pegRNA表达策略的独立贡献
构建了7个水稻先导编辑器，通过PEG介导转染水稻原生质体，孵育48小时后提取基因组DNA，扩增目标片段进行深度测序，每个目标位点重复三次。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 载体构建 | pGreen3双元载体 | -- | -- |
| pCambia双元载体 | -- | -- | |
| pUC57 | -- | -- | |
| 玉米转化 | 农杆菌菌株LBA4404 | -- | -- |
| pVS1-VIR2 | -- | -- | |
| 突变检测 | Sanger测序 | -- | -- |
| Hi-TOM检测 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 玉米转化 | 农杆菌菌株（LBA4404/pVS1-VIR2）和玉米自交系ND73 阅读提示：Methods: Maize transformation and analysis of prime editing |
| 突变检测 | PCR引物（ALS1&2P-F/R, ALS1&2WS-F/R等）、测序方法（直接、克隆、NGS）、克隆数（~86或~106）、NGS阈值（0.5%） 阅读提示：Methods: Maize transformation and analysis of prime editing |
| 水稻原生质体转染 | PEG介导转染、26°C孵育48小时、每个目标位点重复三次 阅读提示：Methods: Rice protoplast transfection and analysis of prime editing |
