构建带有条形码的gRNA文库
确保每个被转导的细胞带有独特的遗传条形码，以实现基因型与转录组的偶联
在慢病毒载体中引入PuroR条形码（位于嘌呤霉素抗性基因5'UTR）和iBAR条形码（位于gRNA第一环），构建gRNA文库（包含JAK1 tiling gRNA和对照gRNA），覆盖约4000万事件。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
scSNV-seq：通过耦合的单细胞基因分型和转录组学对单核苷酸变异进行高通量表型分析
scSNV-seq: high-throughput phenotyping of single nucleotide variants by coupled single-cell genotyping and transcriptomics
实验完整度
高包含体外细胞系中碱基编辑屏幕、单细胞转录组学、单细胞DNA基因分型、功能验证和机制分析等多个独立证据层级。
主要模型
HT-29细胞系（表达doxycycline诱导的胞嘧啶碱基编辑器） JAK1基因碱基编辑库
重点核对
gRNA库克隆包含PuroR条形码和iBAR条形码，每个细胞转导后携带独特条形码 碱基编辑诱导：doxycycline（1 μg/ml）处理72小时 IFN-γ刺激：400 U/ml处理16小时 单细胞基因分型使用Tapestri平台和自定义扩增子，每个barcode组至少3个细胞进行稳健基因型判定 转录组分析使用10X Genomics Chromium X和5'HT试剂盒
摘要
将单细胞转录组读出结合CRISPR筛选是理解遗传扰动（包括与疾病相关的单核苷酸变异）影响的有力工具。然而目前对这些数据的解读受到限制，因为基因型不能仅从向导RNA身份准确推断。scSNV-seq通过将同一细胞的单细胞基因分型和转录组学相结合，克服了这一限制，能够对单核苷酸变异进行准确、高通量的筛选。利用scSNV-seq对JAK1基因中的变异进行分析，展示了确定精准遗传扰动的重要性，并准确地将临床观察到的错义变异分为三类功能类别：良性、功能缺失和功能分离。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何在高通量单细胞CRISPR筛选中准确关联单核苷酸变异（SNV）的基因型与表型，从而精准分类变异功能？
- 核心机制
- JAK1功能缺失导致IFN-γ信号通路下游基因表达下调，包括STAT1、JAK2、IRF9等，并伴有PIK3R1上调，提示JAK-STAT与PI3K信号通路存在交互。
- 主要证据
- 在HT-29细胞中进行JAK1碱基编辑筛选，通过单细胞转录组和DNA基因分型结合条形码，对233个barcode进行基因型判定，发现仅50%的实际基因型与预测一致，功能分类准确率达到96%的精确度和召回率（基于停止密码子和WT的barcode）。
- 研究意义
- scSNV-seq可广泛适用于HDR、prime editing、饱和基因组编辑等引入变异的方法，有助于筛选来自GWAS和癌症基因组测序发现的编码和非编码变异的功能意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
执行碱基编辑筛选
在HT-29细胞中引入JAK1基因的碱基编辑变异
使用表达doxycycline诱导型胞嘧啶碱基编辑器（BE3-NGG）的HT-29克隆系，以约30%感染率转导gRNA文库，经嘌呤霉素筛选，用doxycycline诱导编辑72小时。
瓶颈化及单细胞转录组测序（无基因分型）
获取足够数量的编辑后细胞进行单细胞转录组分析，以识别JAK1功能缺失相关的转录变化
对编辑后细胞进行瓶颈化（15,000个细胞），并使用FACS选择LoF群体（50,000个细胞）。扩增后加载到Chromium X（4个泳道，每泳道目标60,000细胞）进行单细胞转录组测序，使用5'HT试剂盒，并捕获gRNA和iBAR条形码。
单细胞DNA基因分型（scDNA-seq）
确定每个细胞内JAK1基因的精确编辑基因型
将瓶颈化后的细胞（8000个）进一步扩增，使用Tapestri平台进行单细胞DNA测序，使用定制扩增子面板覆盖JAK1外显子和启动子区域，以及gRNA和条形码。同时进行二次瓶颈化（8000个）用于后续转录组测序。
单细胞转录组测序（带基因分型）
获取相同细胞的转录组数据，用于与基因型关联
将用于基因分型相同群体的细胞加载到Chromium X（2个泳道，每泳道目标60,000细胞），进行单细胞转录组测序，同时捕获gRNA和iBAR条形码。
数据分析与基因型-表型关联
将基因型映射到转录组数据，以功能性后果准确定义变异表型
使用Cell Ranger处理scRNA-seq数据，使用混合模型调用gRNA和条形码。对于scDNA数据，使用Tapestri DNA Pipeline处理，GATK HaplotypeCaller进行变异调用。基于barcode组（至少3个细胞）判定基因型，并使用VEP注释后果。整合两个数据集，通过UMAP和聚类比较，使用扩散图计算扩散分数以衡量功能缺失程度。
验证与变异分类
验证基因型调用的准确性，并将错义变异分类为良性、功能缺失或分离功能
通过对比已知功能结果的变异（停止密码子、剪接变异、WT）来评估基因型调用的假阴性和假阳性率。利用扩散分数分布，将错义变异分为低分数（良性）、中间分数（分离功能）和高分数（功能缺失），并分析中间分数的变异特性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
构建筛选文库
单细胞转录组测序
单细胞基因分型
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 载体构建 | KAPA | -- | -- |
| Endura超级感受态细胞 | Lucigen | -- | |
| 细胞培养与筛选 | 嘌呤霉素 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 碱基编辑诱导 | 多西环素 | Sigma Aldrich | -- |
| 细胞刺激 | 干扰素-γ | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 单细胞转录组测序 | Chromium X | 10X Genomics | -- |
| 5'HT试剂盒 | 10X Genomics | -- | |
| 单细胞基因分型 | Tapestri | Mission Bio | -- |
| 测序 | NovaSeq 6000 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 构建gRNA文库 | gRNA文库来源及含量；PuroR和iBAR条形码设计；载体骨架（Addgene #67974） 阅读提示：Methods：gRNA library cloning to include PuroR barcode and iBAR barcode libraries |
| 碱基编辑筛选 | HT-29细胞系及碱基编辑器（BE3-NGG）；感染率；嘌呤霉素浓度；doxycycline浓度和处理时间 阅读提示：Methods：Base editing screens |
| 单细胞转录组测序 | 细胞加载量（Chromium X）；IFN-γ浓度和时间；5'HT试剂盒；gRNA和条形码捕获方法 阅读提示：Methods：Base editing screens；Experiment with genotyping: analysis of scRNA-seq modality |
| 单细胞DNA基因分型 | Tapestri平台；扩增子面板设计；每个反应细胞数；测序平台 阅读提示：Methods：Base editing screens；Experiment with genotyping: analysis of scDNA-seq modality |
| 基因型判定和数据分析 | barcode组最小细胞数（≥3）；变异阈值（≥50%细胞）；VEP注释；扩散图参数 阅读提示：Methods：Experiment with genotyping: analysis of scDNA-seq modality；Experiment with genotyping: analysis of scRNA-seq modality |