2023年肯尼亚沿海地区急性胃肠炎暴发期间通过下一代测序鉴定的人腺病毒多物种共循环

Multispecies Cocirculation of Adenoviruses Identified by Next-Generation Sequencing During an Acute Gastroenteritis Outbreak in Coastal Kenya in 2023

作者信息Arnold W Lambisia, Martin Mutunga, Esther N Katama, Charles N Agoti, Charlotte J Houldcroft
PMID39319086
发布时间2024-09-03
DOI10.1093/ofid/ofae505

实验完整度

中

研究包含粪便样本的qPCR筛查、RespiCoV扩增子测序、WGS测序、系统发育分析及临床严重程度评估,但缺乏功能实验和机制验证,属于分子流行病学观察性研究。

主要模型

儿童粪便样本队列

重点核对

样本时间范围:2022年6月3日至2023年8月28日 纳入标准:年龄小于13岁,腹泻作为疾病症状之一 qPCR检测:使用Pan-HAdV和HAdV-F引物/探针,Ct值<35为阳性 基因分型:使用RespiCoV panel的14种引物进行扩增,ONT测序 HAdV F漏检:长纤维蛋白基因中133个核苷酸缺失导致引物/探针结合位点丧失

摘要

背景:虽然已知存在7种人腺病毒(HAdV)物种,但仅F(40型和41型)和G被确定为腹泻病病原体。其他HAdV物种在腹泻病中的作用仍不清楚,其流行率数据有限。我们描述了肯尼亚沿海地区住院腹泻儿童中的HAdV物种和类型。方法:在2022年6月至2023年8月期间,从年龄小于13岁的儿童中收集了329份粪便样本,使用定量聚合酶链反应(qPCR)筛查HAdV。阳性HAdV病例通过RespiCoV panel的腺病毒引物进行扩增、下一代测序和系统发育分析进行基因分型。结果:65份样本(20%)检测为HAdV阳性,其中鉴定出5种HAdV物种。除HAdV F外,其他物种包括A、B、C和D;这些被检测为单一检测或共感染。NGS鉴定的6个HAdV F被我们的qPCR分型方法漏检。这似乎是由于长纤维蛋白中133个核苷酸的缺失,导致引物和探针结合位点丧失。根据VESIKARI评分对腹泻疾病严重程度进行分级,93%的HAdV病例表现为严重疾病。一名感染HAdV F的儿童死亡。结论:我们的研究显示了肯尼亚沿海地区腹泻儿童中HAdV物种的巨大多样性和临床特征。这些数据为改进当前的诊断检测方法和增加对非洲HAdV的了解以控制未来暴发提供了机会。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
肯尼亚沿海地区住院腹泻儿童中循环的人腺病毒(HAdV)物种和类型有哪些?
核心机制
HAdV F型检测失效的机制:长纤维蛋白基因中133个核苷酸的缺失消除了引物和探针的结合位点。
主要证据
在329份粪便样本中,65份(20%)为HAdV阳性,其中5个物种(A、B、C、D、F)被鉴定;通过NGS鉴定出6个被qPCR漏检的HAdV F;长纤维蛋白扩增和测序显示133个核苷酸缺失影响引物和探针结合。
研究意义
研究结果强调了HAdV的多样性,为改进现有诊断检测方法和增加对非洲HAdV的了解以控制未来暴发提供了机会。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

样本采集和qPCR筛查

筛查腹泻儿童中HAdV的存在。

从329名腹泻儿童粪便样本中提取总核酸,使用Pan-HAdV和HAdV-F引物/探针进行qPCR检测,Ct值<35为阳性。

2

HAdV基因分型(RespiCoV扩增子和ONT测序)

确定HAdV的物种和类型。

对HAdV阳性样本使用RespiCoV panel的14种引物池扩增部分六邻体基因,然后进行ONT测序,并分析部分六邻体序列。

3

全基因组测序进行基因分型验证

确认物种和类型的准确性,并检测可能的漏检。

对HAdV A、C、F样本使用WGS引物扩增,对B和D样本直接进行宏基因组测序,均在Illumina MiSeq平台上测序。将得到的contigs映射到参考基因组生成一致序列,并与部分六邻体基因分型结果比较。

4

长纤维蛋白扩增和Illumina测序

调查HAdV F qPCR漏检的原因。

对qPCR漏检的HAdV F样本,使用设计的引物扩增长纤维蛋白基因,然后进行Illumina测序,分析引物和探针结合位点的变异。

5

系统发育分析

确定HAdV的类型和遗传关系。

将共识序列与全球HAdV序列进行比对,使用MAFFT和iqtree2构建最大似然树,并用ggtree可视化。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

样本或模型特征验证
分子表达变化

产品清单

实验环节名称品牌货号
QIAamp快速粪便DNA微型试剂盒Qiagen--
TaqMan快速病毒一步法预混液Thermo Fisher Scientific--
Q5热启动高保真2X预混液NEB--
GridION测序平台Oxford Nanopore Technologies--
MiSeq测序平台Illumina--
FLOW-MIN106D R9.4.1 流动槽Oxford Nanopore Technologies--
SQK-LSK114连接试剂盒Oxford Nanopore Technologies--
SQK-NBD114.96条形码试剂盒Oxford Nanopore Technologies--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
样本采集
样本来源:肯尼亚基利菲郡医院;纳入标准:<13岁儿童,腹泻症状;样本类型:粪便;采集时间:2022年6月至2023年8月。
阅读提示:Methods: Study Site and Population
核酸提取和qPCR筛查
核酸提取方法:QIAamp Fast DNA Stool Mini kit;qPCR引物和探针序列、Ct阈值、热循环条件。
阅读提示:Methods: Total Nucleic Acid Extraction and Screening
HAdV基因分型
扩增引物:RespiCoV面板的14种腺病毒引物;测序平台:ONT GridION;数据分析流程。
阅读提示:Methods: Partial Hexon Sequencing
全基因组测序
WGS引物:针对A、C、F使用HiFi扩增;B、D使用宏基因组测序;测序平台:Illumina MiSeq。
阅读提示:Methods: Whole-Genome Sequencing
长纤维蛋白分析
用于长纤维蛋白扩增的引物序列;测序平台;分析流程。
阅读提示:Methods: Long Fiber Amplification and Illumina Sequencing