样本采集和qPCR筛查
筛查腹泻儿童中HAdV的存在。
从329名腹泻儿童粪便样本中提取总核酸,使用Pan-HAdV和HAdV-F引物/探针进行qPCR检测,Ct值<35为阳性。
Multispecies Cocirculation of Adenoviruses Identified by Next-Generation Sequencing During an Acute Gastroenteritis Outbreak in Coastal Kenya in 2023
研究包含粪便样本的qPCR筛查、RespiCoV扩增子测序、WGS测序、系统发育分析及临床严重程度评估,但缺乏功能实验和机制验证,属于分子流行病学观察性研究。
儿童粪便样本队列
样本时间范围:2022年6月3日至2023年8月28日 纳入标准:年龄小于13岁,腹泻作为疾病症状之一 qPCR检测:使用Pan-HAdV和HAdV-F引物/探针,Ct值<35为阳性 基因分型:使用RespiCoV panel的14种引物进行扩增,ONT测序 HAdV F漏检:长纤维蛋白基因中133个核苷酸缺失导致引物/探针结合位点丧失
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
筛查腹泻儿童中HAdV的存在。
从329名腹泻儿童粪便样本中提取总核酸,使用Pan-HAdV和HAdV-F引物/探针进行qPCR检测,Ct值<35为阳性。
确定HAdV的物种和类型。
对HAdV阳性样本使用RespiCoV panel的14种引物池扩增部分六邻体基因,然后进行ONT测序,并分析部分六邻体序列。
确认物种和类型的准确性,并检测可能的漏检。
对HAdV A、C、F样本使用WGS引物扩增,对B和D样本直接进行宏基因组测序,均在Illumina MiSeq平台上测序。将得到的contigs映射到参考基因组生成一致序列,并与部分六邻体基因分型结果比较。
调查HAdV F qPCR漏检的原因。
对qPCR漏检的HAdV F样本,使用设计的引物扩增长纤维蛋白基因,然后进行Illumina测序,分析引物和探针结合位点的变异。
确定HAdV的类型和遗传关系。
将共识序列与全球HAdV序列进行比对,使用MAFFT和iqtree2构建最大似然树,并用ggtree可视化。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 核酸提取 | QIAamp快速粪便DNA微型试剂盒 | Qiagen | -- |
| PCR | TaqMan快速病毒一步法预混液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Q5热启动高保真2X预混液 | NEB | -- | |
| 测序 | GridION测序平台 | Oxford Nanopore Technologies | -- |
| MiSeq测序平台 | Illumina | -- | |
| FLOW-MIN106D R9.4.1 流动槽 | Oxford Nanopore Technologies | -- | |
| SQK-LSK114连接试剂盒 | Oxford Nanopore Technologies | -- | |
| SQK-NBD114.96条形码试剂盒 | Oxford Nanopore Technologies | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本采集 | 样本来源:肯尼亚基利菲郡医院;纳入标准:<13岁儿童,腹泻症状;样本类型:粪便;采集时间:2022年6月至2023年8月。 阅读提示:Methods: Study Site and Population |
| 核酸提取和qPCR筛查 | 核酸提取方法:QIAamp Fast DNA Stool Mini kit;qPCR引物和探针序列、Ct阈值、热循环条件。 阅读提示:Methods: Total Nucleic Acid Extraction and Screening |
| HAdV基因分型 | 扩增引物:RespiCoV面板的14种腺病毒引物;测序平台:ONT GridION;数据分析流程。 阅读提示:Methods: Partial Hexon Sequencing |
| 全基因组测序 | WGS引物:针对A、C、F使用HiFi扩增;B、D使用宏基因组测序;测序平台:Illumina MiSeq。 阅读提示:Methods: Whole-Genome Sequencing |
| 长纤维蛋白分析 | 用于长纤维蛋白扩增的引物序列;测序平台;分析流程。 阅读提示:Methods: Long Fiber Amplification and Illumina Sequencing |