脱靶位点预测
比较CIRCLE-seq和ISP两种脱靶预测方法对4种gRNA的预测结果，并评估其可重复性及动物间差异。
对PPP1R12C、DNMT3A、TET2和CD33 gRNA进行计算机模拟预测（ISP）和CIRCLE-seq实验，并分析技术重复和不同动物DNA样本的重复性。
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移植恒河猴中造血干细胞和祖细胞脱靶编辑的预测与验证
Prediction and validation of hematopoietic stem and progenitor cell off-target editing in transplanted rhesus macaques
实验完整度
高包含体外预测（CIRCLE-seq）、计算机预测、移植模型体内验证、错误校正测序验证及易位检测等多个独立证据层级。
主要模型
恒河猴自体移植模型 CD34+造血干细胞和祖细胞（HSPCs） 粒细胞、T细胞、B细胞、NK细胞
重点核对
CD33 gRNA序列及截短为18 bp CIRCLE-seq实验条件（基因组DNA来源、Cas9和gRNA浓度等） AmpliSeq HD测序的UMI和判读标准 移植动物的辐照剂量和细胞输注 CAST-seq检测易位的实验条件
摘要
可编程核酸酶技术CRISPR-Cas9在过去十年中彻底改变了基因编辑。由于脱靶编辑的风险，在将CRISPR-Cas9治疗性应用之前，准确灵敏的脱靶特征分析方法至关重要。在此，我们利用恒河猴模型比较了CIRCLE-seq（一种体外脱靶预测方法）与仅基于基因组序列比较的计算机模拟预测（ISP）的预测价值。我们使用AmpliSeq HD错误校正测序验证了CIRCLE-seq和ISP预测的CD33向导RNA（gRNA）的脱靶位点，该gRNA有数千个ISP和CIRCLE-seq预测的脱靶位点。我们发现两种方法预测的位点之间相关性较差。当对每种方法预测的近500个位点进行移植后造血细胞的错误校正测序分析时，有19个脱靶位点显示出插入或缺失突变。在这些位点中，8个位点被两种方法预测，8个位点仅被CIRCLE-seq预测，3个位点仅被ISP预测。在长达2年的随访中，这些脱靶编辑细胞水平在体内未表现出扩增或异常行为。此外，我们利用一种名为CAST-seq的无偏方法搜索移植后动物体内靶向位点与脱靶位点之间的易位，检测到一种特异性易位，该易位在移植后至少在血细胞中持续存在了1年。总之，CIRCLE-seq和ISP均未预测出所有位点，可能需要将仔细的gRNA设计，随后通过多种方法对靶细胞中预测的脱靶位点进行筛选相结合，以优化临床开发的安全性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CIRCLE-seq和计算机模拟预测（ISP）在预测体内真实脱靶编辑方面的预测价值如何？
- 核心机制
- 文中未明确说明
- 主要证据
- 通过CIRCLE-seq和ISP预测脱靶位点，利用错误校正测序在移植恒河猴的造血细胞中验证，发现19个真实脱靶位点，其中8个被两种方法预测，8个仅被CIRCLE-seq预测，3个仅被ISP预测；CAST-seq检测到一种持续存在的易位。
- 研究意义
- 研究结果表明，单独使用CIRCLE-seq或ISP均不能预测所有脱靶位点，需要结合多种方法进行筛选以确保临床开发的安全性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
初步验证
在CD33编辑的HSPC移植产品中初步验证高排名脱靶位点。
对输注产品DNA进行靶向Illumina测序，分析CS和ISP排名前15的位点。
大规模验证
利用错误校正测序对TET2和CD33 gRNA的预测脱靶位点进行高灵敏度验证。
设计AmpliSeq HD靶向panel，对移植后恒河猴的粒细胞和淋巴细胞进行测序，鉴定真实脱靶位点。
体内跟踪和功能评估
评估脱靶编辑在体内的持久性、对造血谱系的影响，以及是否引起克隆扩增。
在移植后不同时间点采集血细胞，检测脱靶位点编辑频率，分析多谱系（粒细胞、T、B、NK细胞）中的编辑情况，并跟踪长达2年。
染色质可及性分析
探索染色质可及性对脱靶编辑的影响。
利用人HSPC的ATAC-seq数据（GEO: GSE96772），将CD33预测脱靶位点映射到开放染色质区域，与体内验证的脱靶位点比较。
易位检测
检测由脱靶编辑引起的染色体易位。
使用CAST-seq对移植后2周和1个月的PBMC和粒细胞DNA进行检测，并利用靶向测序验证易位。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| gRNA设计 | Benchling网络工具 | -- | -- |
| 基因组DNA提取 | Gentra Puregene试剂盒 | QIAGEN | -- |
| DNA片段化 | Covaris S2 | Covaris | -- |
| CIRCLE-seq | KAPA HTP文库制备试剂盒（无PCR） | KAPA Biosystems | -- |
| Lambda核酸外切酶 | New England Biolabs | -- | |
| 大肠杆菌核酸外切酶I | New England Biolabs | -- | |
| USER酶 | New England Biolabs | -- | |
| T4多核苷酸激酶 | New England Biolabs | -- | |
| T4 DNA连接酶 | New England Biolabs | -- | |
| Plasmid-Safe ATP依赖性DNase | Epicenter | -- | |
| SpCas9蛋白 | New England Biolabs | -- | |
| Cas9核酸酶缓冲液 | New England Biolabs | -- | |
| GeneArt试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 化学修饰合成gRNA | Synthego | -- | |
| 用于Illumina的Next多重寡核苷酸 | New England Biolabs | -- | |
| Kapa HiFi聚合酶 | KAPA Biosystems | -- | |
| 测序 | Illumina MiSeq | Illumina | -- |
| 细胞培养 | X-VIVO 10培养基 | Lonza | -- |
| 人血清白蛋白 | Baxter | -- | |
| 干细胞因子 | PeproTech | -- | |
| FMS样酪氨酸激酶3配体 | PeproTech | -- | |
| 促血小板生成素 | PeproTech | -- | |
| 细胞电转 | Opti-MEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| BTX ECM 830方波电转系统 | Harvard Apparatus | -- | |
| 细胞分离 | 淋巴细胞分离液 | MP Biomedicals | -- |
| ACK裂解缓冲液 | Quality Biological | -- | |
| 细胞分选 | BD FACSAria II | BD | -- |
| AmpliSeq HD | Ion AmpliSeq HD文库制备试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Ion AmpliSeq HD双条形码试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| IonChef仪器 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| IonTorrent S5仪器 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Ion 530芯片 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Ion 550芯片 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| S5 Torrent服务器 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Torrent Variant Caller 5.12 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 靶向Illumina测序 | NEBNext Multiplex Oligos用于Illumina（双索引引物组1） | New England Biolabs | -- |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix聚合酶 | KAPA Biosystems | -- | |
| CRISPResso | -- | -- | |
| CAST-seq | NEBNext Ultra II FS DNA文库制备试剂盒（用于Illumina） | New England Biolabs | -- |
| NEBNext Ultra II连接主混合物 | New England Biolabs | -- | |
| 连接增强剂 | New England Biolabs | -- | |
| Q5热启动HF DNA聚合酶 | New England Biolabs | -- | |
| NEBNext Ultra II Q5主混合物 | New England Biolabs | -- | |
| 易位验证 | QIAquick凝胶回收试剂盒 | QIAGEN | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| gRNA设计 | CD33 gRNA序列为截短的18 bp，来源于人gRNA；TET2 gRNA由Benchling设计。 阅读提示：Methods中的gRNA design部分及表S6 |
| CIRCLE-seq | 基因组DNA来源（CD34-细胞）、片段化大小（约300 bp）、Cas9和gRNA浓度（90 nM）、gRNA类型（TET2体外转录，CD33化学修饰）、测序平台（Illumina MiSeq）。 阅读提示：Methods中的CS部分 |
| 移植实验 | 恒河猴品系、CD34+细胞纯化方法、电转参数（400 V，5 ms）、辐照剂量（400-500 cGy/day）、细胞输注量。 阅读提示：Methods中的autologous transplantation部分及图S2和表S6 |
| AmpliSeq HD | panel位点选择（TET2：所有CS位点和ISP前40；CD33：CS前500和ISP前500）、DNA量（20 ng）、测序平台（IonTorrent S5）、变异判读标准。 阅读提示：Methods中的AmpliSeq HD部分及图S3 |
| 脱靶位点判读标准 | 仅考虑插入缺失（indel）、排除与gRNA 18 bp窗口完全不重叠的indel、需在对照中不存在、频率>0.05%等共5条标准。 阅读提示：Results中的“应用错误校正测序…”部分 |
| CAST-seq | 适配器序列、PCR引物、起始DNA量、循环条件、测序平台。 阅读提示：Methods中的Detection of translocations部分及表S14 |