ASO筛选与优化
鉴定能够高效促进EZH2外显子14跳跃的ASO分子。
在MHCC97H细胞中进行ASO扫描，通过三步筛选（粗扫、微扫、优化）确定先导ASO ASO35-58。
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靶向EZH2的反义寡核苷酸介导的外显子跳跃抑制肝细胞癌异种移植小鼠模型中的肿瘤生长
Antisense-mediated exon skipping targeting EZH2 suppresses tumor growth in a xenograft mouse model of hepatocellular carcinoma
实验完整度
高包含ASO筛选、体外细胞功能实验、RNA-seq通路分析、小鼠外周组织验证及原位异种移植瘤模型等多层级验证，并有机制研究。
主要模型
MHCC97H人肝癌细胞系 HCCLM3人肝癌细胞系 C57BL/6小鼠 NSG小鼠原位异种移植模型（MHCC97H-luc细胞）
重点核对
ASO35-58序列及修饰（MOE/PS，5-甲基胞嘧啶） ASO转染浓度（25、50 nM）及处理时间（30 h） 细胞系：MHCC97H、HCCLM3 小鼠给药剂量与方案（100 mg/kg/天，皮下注射，连续8天） 原位移植物细胞数量（1×10^6）及成瘤时间（10天）
摘要
果蝇zeste基因增强子同源物2（EZH2）催化组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化（H3K27me3），该修饰促进异染色质形成和基因沉默。EZH2在包括肝细胞癌（HCC）在内的多种恶性肿瘤中表达经常升高。沉默EZH2已被视为阻止癌症进展的有前景的策略。在此，我们鉴定了能够通过促进EZH2外显子14（编码必需CXC结构域部分的外显子）跳跃来有效沉默EZH2的反义寡核苷酸（ASOs），增加了内部缩短亚型（该亚型对全长EZH2发挥显性负效应）的产生。一种先导ASO与SRSF3结合的外显子剪接增强子元件杂交，不仅在培养的人HCC细胞系中，而且在小鼠外周组织中全身给药后，均能强烈促进外显子14跳跃，导致EZH2和H3K27me3水平显著降低。该先导ASO通过多种机制有效抑制HCC细胞增殖，包括增强细胞凋亡、细胞周期阻滞和逆转上皮-间质转化，这可能归因于多种癌症相关通路的抑制。在肝癌原位异种移植小鼠模型中，ASO治疗抑制了肿瘤生长、改善了组织表型并延长了中位生存期。我们的数据突出了先导外显子跳跃ASO在治疗HCC中的治疗潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 开发通过反义寡核苷酸介导的EZH2外显子14跳跃来抑制肝细胞癌的可行策略。
- 核心机制
- ASO35-58通过结合EZH2外显子14上的SRSF3结合增强子元件，促进外显子14跳跃，产生不稳定的、具有显性负效应的EZH2Δ14亚型，从而降低EZH2和H3K27me3水平，抑制多种癌症相关信号通路。
- 主要证据
- 体外实验中ASO35-58有效促进外显子14跳跃，降低EZH2和H3K27me3水平，抑制细胞增殖、诱导凋亡和G2/M期阻滞；RNA-seq显示多个癌症相关通路被抑制；在原位异种移植模型中，ASO35-58抑制肿瘤生长、延长中位生存期。
- 研究意义
- 该先导ASO具有治疗HCC的临床潜力，并可能应用于其他外周组织肿瘤。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证外显子14跳跃效应及蛋白水平影响
确认ASO35-58在肝癌细胞中诱导的外显子14跳跃对EZH2蛋白及H3K27me3水平的影响。
在MHCC97H和HCCLM3细胞中转染ASO35-58，通过sqRT-PCR和Western blot检测外显子跳跃百分比及蛋白水平。
机制探究：EZH2Δ14稳定性及显性负效应
阐明EZH2Δ14对全长EZH2的显性负效应及其不稳定性的分子机制。
通过脉冲追踪实验比较EZH2和EZH2Δ14的稳定性；通过泛素化实验检测EZH2Δ14的泛素化；通过过表达实验验证EZH2Δ14对H3K27me3的影响。
鉴定ASO35-58靶向的顺式元件及反式因子
揭示ASO35-58作用的分子基础，即外显子14上的增强子序列及其结合蛋白。
通过minigene缺失突变和点突变分析确定关键序列；通过siRNA敲低和过表达实验筛选候选RBPs；通过RNA亲和色谱验证SRSF3与AUCAUC元件的结合。
体外功能验证
评估ASO35-58对肝癌细胞增殖、凋亡、细胞周期和迁移的影响。
通过集落形成、细胞活力、划痕愈合实验检测细胞增殖和迁移；通过流式细胞术分析凋亡和细胞周期；通过Western blot检测凋亡和细胞周期相关蛋白。
RNA-seq通路分析
探究ASO35-58处理后细胞早期分子事件及影响的信号通路。
对ASO35-58、mismatch、buffer处理的MHCC97H细胞进行RNA-seq，比较差异表达基因，进行KEGG和GSEA分析，并验证PI3K-Akt和MAPK通路蛋白变化。
体内验证
评估ASO35-58在健康小鼠和疾病模型中的药效及安全性。
在健康小鼠中检测ASO35-58对Ezh2外显子14跳跃的诱导效果；在原位异种移植模型中评估对肿瘤生长、生存期及组织学的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Life Technologies | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Hyclone | -- | |
| 细胞转染 | ExFect转染试剂 | Vazyme | -- |
| ASO处理 | ASO35-58 | Olipharma | -- |
| 错配ASO | Olipharma | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Vazyme | -- |
| RT-PCR | SuperMix试剂盒 | TransGen Biotech | -- |
| qRT-PCR | SYBR qRT-PCR试剂盒 | TransGen Biotech | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | MedChemExpress | -- | |
| 磷酸酶抑制剂 | MedChemExpress | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| IRDye 680RD山羊抗小鼠二抗 | LI-COR Biosciences | -- | |
| IRDye 680RD山羊抗兔二抗 | LI-COR Biosciences | -- | |
| 抗EZH2抗体 | -- | -- | |
| 抗H3K27me3抗体 | -- | -- | |
| 免疫沉淀 | 抗Flag抗体 | -- | -- |
| 抗HA抗体 | -- | -- | |
| 蛋白A/G琼脂糖珠 | Beyotime | -- | |
| RNA亲和色谱 | 链霉亲和素磁珠 | -- | -- |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | MedChemExpress | -- |
| 流式分析 | Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒 | TransGen Biotech | -- |
| 细胞周期分析试剂盒 | MedChemExpress | -- | |
| NovoCyte 2040R流式细胞仪 | ACEA | -- | |
| RNA-seq | Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- |
| 动物实验 | D-荧光素 | -- | -- |
| 组织学分析 | 抗Ki-67抗体 | -- | -- |
| 山羊抗兔辣根过氧化物酶标记抗体 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 柠檬酸缓冲液 | Keygen Biotech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| ASO处理及细胞实验 | ASO序列，浓度，处理时间，细胞系 阅读提示：Materials and methods: ASOs and plasmids, Cell culture, transfection; Results: Figure 2A |
| 蛋白稳定性实验 | 环己酰亚胺浓度，处理时间点，细胞系 阅读提示：Materials and methods: Cell culture; Results: Figure 2C |
| RNA-seq实验 | ASO浓度，处理时间，样本数，差异基因筛选标准 阅读提示：Materials and methods: RNA-seq; Results: Figure 6 |
| 动物实验（健康小鼠） | 小鼠品系，给药剂量，给药方式，给药天数，组织取样时间 阅读提示：Materials and methods: Animal studies; Results: Figure 7A |
| 动物实验（原位异种移植模型） | 细胞系及数量，注射部位，肿瘤生长时间，给药剂量及方案，成像时间点 阅读提示：Materials and methods: Animal studies; Results: Figure 8A |