01研究背景

 

甘草是中药又是食品甜味剂，主要生长在宁夏、甘肃、内蒙古和新疆地区，气候和其他因素会影响其质量和化学成分。甘草的质量评价、活性化合物测定、指纹图谱结合定量分析主要集中在一些化合物的分析上，而传统的UHPLC-HRMS（超高效液相色谱-高分辨质谱）数据分析只能识别甘草中几种常见的离子类型。本篇研究以非靶向代谢组学的一种新内源算法即碎片离子识别算法和离子融合算法，识别鉴定甘草碎片离子和代谢物，区分不同产地甘草，实现高通量数据采集和挖掘。

 02前言

 

宁夏医科大学药学院于永杰教授在Food Chemistry期刊（IF：8.8）发表的题为 “Chemometric discrimination of the geographical origin of licorice in China by untargeted metabolomics ”的研究成果，通过碎片离子识别算法、离子融合算法和化学计量法等方法，发现了甘草代谢物正负离子模式的色谱特征，为甘草代谢物鉴定和地理识别提供了理论依据。

 

 

 03研究思路

 

 

 04研究方法

研究材料

（1）宁夏甘草：151个

（2）甘肃甘草：26个

（3）新疆甘草：30个

（4）内蒙甘草：62个

 

研究技术

1.基于UPLC-QTOF-MS（超高效液相色谱-四极杆-高分辨飞行时间质谱）的非靶向代谢分析：甘草代谢物分析

2.碎片离子识别算法：甘草代谢物碎片离子鉴定

3.离子融合算法：甘草离子识别和离子融合

4.化学计量法：鉴别不同产地甘草

 

 05研究结果

 

1、甘草代谢谱特征分析

对四个省份的甘草样品进行UHPLC-HRMS正、负离子分析，发现两种离子模式下均可观察到代谢物的变化。通过比较代谢物谱、半定量分析和方差分析，正、负离子模式下分别发现837个、755个特征信息（图1）。

 

图1|碎片离子识别算法

 

2.1 碎片离子识别算法鉴定甘草代谢物

通过峰面积方差分析对不同地区甘草进行特征分析，发现超过79%的样品色谱相似性值在0.975以上。同位素离子等对应的所有离子构建色谱矩阵，通过SVD（奇异值分解）分析得到质谱。根据碎片离子鉴定方法，鉴定出准分子离子丰度较低的代谢物，正离子模式下构建480个质谱，其中113个质谱涉及至少3个碎片离子；负离子模式构建438个，其中65个质谱包含至少3个碎片离子（图1）。

 

2.2 离子融合算法鉴定甘草代谢物

正负离子模式下构建的质谱对应于同一代谢物。根据离子融合法，负离子模式下，刺芒柄花素-7-o-葡萄糖苷（芒柄花苷）可清楚地找到正离子模式的准分子离子，导入构建的正离子模式质谱，鉴定出相同的化合物刺芒柄花素-7-o-葡萄糖苷（芒柄花苷）。说明离子融合算法可准确地整合正离子和负离子模式质谱，有利于代谢物的鉴定（图2-3）。本研究中，离子融合构建了至少3个碎片离子质谱，即113个正离子模式质谱和67个负离子模式质谱，两种离子模式下均可发现26种组分。

 

图2|离子融合算法

 

图3|离子融合算法鉴定化合物

 

2.3 基于开发策略的甘草代谢产物鉴定

基于开发策略，甘草代谢物谱模式下，正离子代谢产物比负离子更丰富。因此，基于正离子模式构建113个质谱分子网络。113个质谱划分为三个区域，第一个区域标记为糖苷相关代谢物(图4绿色区域)，第二个区域为甘草酸相关代谢物(图4橙色区域)，最后一个区域位于网络的中心位置(图4蓝色区域)。

 

图4|基于正离子模式构建的113个质谱网络分析

 

3、不同地区甘草的地理识别

通过化学计量聚类方法构建地理判别模型，以揭示不同产地甘草中的化学成分差异。FDA(Fisher判别分析)主要利用判别法提取判别特征。研究通过构建3种地理模型，包括基于正离子模式下的模型、基于负离子模式下的模型和将筛选的所有成分组合在一起的混合模型，正离子模式下的FDA和SVM（支持向量机）地理模型均略优于负离子模式和混合模式。结果表明，正离子模式下进行的UHPLC-HRMS分析可为甘草的地理鉴别提供准确结果，在校准和预测样品上提供了更高的准确度值(图5-6)。

 

图5|PCA、PLS-DA和FDA样本聚类分析

 

图6|蒙特卡洛模型校准预测甘草样本精度

 

 06研究结论

 

碎片离子识别算法和离子融合算法识别了不同地区甘草，有利于正负离子模式质谱的构建整合。化学计量学方法建立的正离子模式下的SVM模型适合中国不同地区甘草样本的地理识别，不仅提供甘草地理鉴别的准确结果，也提高了甘草代谢物鉴定的准确性。

 

 

文章推荐

 

 

本篇研究以一种新的内源算法碎片离子识别算法和离子融合算法，对中国不同地区甘草进行非靶向代谢组学分析。通过化学计量学方法评估代谢组学数据并建立地理区分模型，不仅提高了甘草代谢物鉴定的准确性，追溯中国甘草地理来源，也为进一步研究不同地区甘草提供了新方向新思路。

 

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参考文献

1.Bai, H., Bao, F., Fan, X., Han, S., Zheng, W., Sin, L.i., et al. (2020). Metabolomics study of differentparts of licorice from different geographical origins and their anti-inflammatory activities. Journal of Separation Science, 43, 1593–1602.

 

2. Ballabio, D., & Consonni, V. (2013). Classification tools in chemistry. Part 1: Linear models. PLS-DA. Analytical Methods, 5, 3790–3798.

3.Brigante, F. I., Podio, N. S., Wunderlin, D. A., & Baroni, M. V. (2022). Comparative metabolite fin-gerprinting of chia, flax and sesame seeds using LC-MS untargeted metabolomics. Food Chemis-try, 371, Article 131355.

4.Ding, S., Zhu, Z., & Zhang, X. (2017). An overview on semi-supervised support vector machine.Neural Computing & Applications, 28, 969–978.

5. Domingo-Almenara, X., Montenegro-Burke, R. J., Guijas, C., Majumder, E. L. W.,Benton, P. H., &Siuzdak, G. (2019). Autonomous METLIN-Guided in-source fragment annotation for untargeted metabolomics. Analytical Chemistry, 91,3246–3253.

 

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文末看点｜lumingbio

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