01研究背景
酪蛋白激酶1S(Casein kinase1S，CK1s)是真核生物中高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过靶蛋白的磷酸化来调节多种发育和信号事件。拟南芥早花样蛋白1 (Arabidopsis early flowering 1 (EL1)-like，AELs)是植物特有的具有多种功能的CK1 (酪蛋白激酶AELs)，但其底物的鉴定和验证是阐明其生理功能的主要瓶颈。作者采用来自鹿明生物的数据独立获取模式（DIA）的磷酸化蛋白质组学分析技术，系统地鉴定了CK1底物。作者通过生化和遗传分析对新发现的底物C3H17进行了功能鉴定，揭示了AELs促进的C3H17蛋白的稳定性和反式激活活性在调控胚胎发育中的作用。这项工作拓展了CK1介导的磷酸化的机制研究。

02前言
2023年08月，上海交通大学薛红卫团队在Science Bulletin期刊（IF：18.9）发表的题为 “Data-independent acquisition-based global phosphoproteomics reveal the diverse roles of casein kinase 1 in plant development”的研究成果，通过据独立获取模式（DIA）的磷酸化蛋白质组学研究技术，揭示全面揭示I型酪蛋白激酶的在植物发育中的功能。本文中，由鹿明生物提供磷酸化蛋白质组学技术支持。
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03研究思路

04研究方法
研究材料
（1） 拟南芥哥伦比亚-0生态型
（2） T-DNA插入系C3H17-1(SALK_022423)和C3H17-2(SALK_099650) 拟南芥
（3） 大肠杆菌

研究技术
DIA磷酸化蛋白质组学

05研究结果
1. 基于DIA的不同AELs活性拟南芥的磷酸蛋白质组学

为为了研究AELs的作用机制，作者从高表达单个AELs基因或缺乏一个或多个AELs功能的幼苗中收集样本。提取总蛋白，胰酶消化，使用数据依赖获取(DIA)模式进行捕获 (图2)。作者进一步鉴定了多肽序列并确定了特定的修饰位点。获得了9283个可信的磷肽 (图1A)。约72.6%和19.5%的已鉴定磷酸化多肽分别含有一个或两个磷酸化位点(图1B)，主要分布在丝氨酸(70.3%)、苏氨酸(22.9%)和酪氨酸(6.7%)(图1C)。在这些磷酸肽中，作者选择了3985个在AELs-OE系中相对于Col-0丰度较高的磷酸肽。相反，作者将下调的磷酸肽定义为在AELs-OE系中具有较低丰度的那些（图3)。因此，作者鉴定了1032个与3985个可信的上调的磷酸肽中的至少一个匹配的磷蛋白。

2. 丰富的AELs新底物基序 

接基于识别的AELs上调的磷酸肽，作者用Motif-X算法(图1)定义了8个过度表达的底物基序，为了验证新鉴定底物性质和准确性，作者选择了10种具有代表性的蛋白质(图1E)，其磷酸化位点与上述基序相匹配，用于体外磷酸化分析。从大肠杆菌中纯化了含有非磷酸化位点与重组AELs1孵育，所有重组蛋白在AELs1存在下都被特异性地磷酸化，大多数非磷酸化的变体显示出较低的AELs1磷酸化(图1E)。对包含新浓缩基序的两种AELs底物UVB抗性8(UVR8)和卵黄蛋白原2蛋白(Vit)的免疫印迹分析表明，它们的磷酸化水平随AELs活性水平的变化而变化(图1F)。这些结果证实了作者鉴定的富含基序的准确性，并表明这里检测到的磷蛋白可以被AELs直接磷酸化。

 

作者结合蛋白质-多肽对接和蛋白质-蛋白质对接进行了基于模板的建模，以研究AELs1与其同源基序结合的特异性。对接数据表明，底物中结合区的结构与预测的含短磷肽基序的结构一致(图2)。进一步预测AELs1与磷酸化多肽之间的蛋白质-肽对接，表明AELs1与磷酸化基序之间的结合界面很强 (图1G)。此外，对已报道的两个底物基序蔗糖非发酵-1相关蛋白激酶2对接模型表明，它们深深嵌入SnRK2中 (图1H)。这表明基序特异性在不同的激酶磷酸化过程中起着至关重要的作用。

图1 AELs磷酸化基序的鉴定和验证

3.  AELs在拟南芥中的功能

作者使用基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)途径分析。揭示了AELs可能参与了信号级联和基因表达调控。对这些候选底物的功能注释揭示了AELs在调节根、叶、茎、角果和花发育方面的不同假定功能(图2A)，扩大了AELs控制下的生物事件的范围。对前25个GO富集项和3509个预测底物的分析暗示了AELs参与的主要生物学途径，特别是代谢和细胞周期。除了先前报道的GO术语(图2B)外，对3509预测的AELs底物的功能注释发现了更多新的GO类别，特别是与各种生物胁迫有关的术语，还发现了与植物激素生长素、茉莉酸和细胞分裂素的反应有关的术语的丰富；此外，作者注意到与受体介导的内吞作用和RNA剪接或加工有关的术语。这些新发现的GO富集物和底物将增加对AELs功能和监管串扰的理解。作者还发现新的底物参与了以前报道的CK1功能(图2C)。作者观察到与开花时间调控有关的AELs底物的几个功能类别的丰富：昼夜节律以及光周期和春化途径(图2C)。因此，AELs介导的磷酸化对花的转换和开花时间具有广泛的影响。

图2 基序预测的底物的AELs的功能分析

4. AELs和C3H17参与胚胎发育 

作者从AELs上调的磷酸肽中鉴定出一种名为C3H17(UniProt ID：Q9ZUM0)的非串联CCCH锌指蛋白，它在与生殖和胚胎发育相关的几个生物过程的交叉点上占据着中心位置(图3A)。这一结果提示AELs可能通过不同底物的磷酸化参与胚胎发育。与这一概念一致，在受精后7天对AELs三重突变体的角果进行了观察，发现存在败育的种子(图3B)。作者在AELs-OE系或AELs单突变体或双突变体中没有观察到明显的异常(图3B)。这表明AELs可能多余地调节与胚胎发育相关的过程。显微镜观察显示，AELs三重突变体早期发育阶段的胚胎异常，即大量延迟或悬浮的胚胎，以及顶端细胞无组织增殖的异常胚胎，导致胚胎发育受阻，无法从球形阶段到达后续阶段(图3C)。

 

作者进行了酵母双杂交(图2)。表明所有的AELs都与C3H17相互作用。双分子荧光互补(BIFC)分析(图3E)和Co-IP分析(图3F)验证了AELs1-C3H17在体内的相互作用。用识别的基序预测磷酸化位点显示了几个与C3H17匹配的多肽 (图3G)。放射自显影测定证实重组AELs1直接磷酸化C3H17(图3H)。

 

用抗HA磁珠进行免疫沉淀。与C3H17-HA相比，C3H17 AA在AELs123幼苗中的磷酸化水平甚至最低(图3j)，证实了S492和T585是植物中AELs作用的主要磷位点。

 

 

图3 AELs和C3H17调节拟南芥胚胎发育

5. AELs介导的磷酸化促进C3H17蛋白的稳定性和反式激活活性

蛋白质磷酸化通常会影响酶底物的稳定性或活性。为了研究AELs1介导的C3H17磷酸化对C3H17的影响，在体外无细胞实验中检测了C3H17的稳定性 (图4B)，这一结果表明，AELs介导的磷酸化抑制了C3H17的降解，从而提高了C3H17在体内的稳定性。C3H17作为转录激活剂发挥作用。对下游基因转录检测表明， OLEO2和CRU3在AELs三重突变体中的表达水平低于Col-0(图4F)。萤火虫荧光素酶(LUC)报告基因进行了瞬时荧光素酶活性测定 (图4h)，证实AELs通过磷酸化促进C3H17的反式激活活性。

图4 T2A2组件可防止葡萄球菌生物膜的形成，并根除成熟的生物膜

6. AELs介导的C3H17磷酸化对胚胎发育至关重要
通过将高表达C3H17、C3H17 AA 的纯合子AELs123系与Col-0或AELs1-Oe杂交，进一步获得了在不同背景下表达C3H17或变异体的转基因株系。种子败育评分表明，C3H17，特别是C3H17 DE 的过表达挽救了AELs123中的胚胎败育表型，而C3H17 AA 的过表达加剧了AELs123、Col-0甚至AELs1-OE的胚胎败育(图5A)，证实了AELs通过磷酸化C3H17在胚胎发育中发挥关键作用。

对表达角果的幼粒进行了转录组深度测序(RNA-seq)。结果表明AELs和C3H17的作用相似。KEGG途径分析表明，大多数Codeg富含与生殖相关的途径，特别是在共同下调的基因中(图5B)，而与胚胎后发育或生殖过程的负调控相关的途径在共上调的基因中丰富(图4F)，证实了AELs-C3H17对胚胎发育的调控。在表达C3H17 AA 的AELs123和AELs123幼苗中发现的一致相似的表达模式，以及在表达C3H17 DE 的AELs123幼苗中一致相反的模式，证实了AELs通过C3H17介导的磷酸化对胚胎发育的特异性影响。

异戊烯基转移酶7等基因在RT-qPCR分析表明，在表达C3H17 DE 的AELs123幼苗中被诱导(图5D)，这表明这些基因可能以一种依赖于C3H17磷酸化的方式在C3H17下游发挥作用，并可能在胚胎发育中发挥重要作用，特别是在从球形向心脏阶段的转变过程中。

图5 小鼠腹膜感染模型

7. 植物和哺乳动物中CK1的扩展底物预测

鉴于CK1的保守性，作者对人类和小鼠的CK1候选底物进行了类似的比较分析，发现功能上有很高的相似性(图6A)。值得注意的是，染色体和染色质组织，细胞分裂中的关键事件，出现在前三个GO术语中，丰富了来自人和小鼠的CK1候选底物(图6A)，与拟南芥相似，表明细胞分裂是真核生物中受CK1调控的最重要和最保守的生物学机制。对CK1底物的GO分析在拟南芥和人类中分别返回了3143和8283个GO术语，其中2099个是共享的，其中大多数代表了新发现的与各种生物和细胞活动的联系(图6B)。此外，作者确定了许多与DNA复制、DNA损伤和修复以及细胞周期有关的候选底物(图6B)。

图6 皮下感染模型

06研究结论
蛋白质磷酸化在调节细胞和信号通路中起着至关重要的作用。AELs/CK1因其在多种生理机制中的重要作用而备受关注，尽管对其底物的全面鉴定仍然是限制其功能阐明的主要瓶颈。在这里，作者使用了一种鹿明生物提供的基于DIA的磷酸化蛋白质组学方法来系统地鉴定AELs底物，这极大地提高了对AELs通过磷酸化发挥的功能和调节机制的广度的理解。

文章推荐
在这项研究中， 作者运用由鹿明生物提供的基于DIA的磷酸化蛋白质组学方法来系统地鉴定AELs底物。研究中形成的数据库资源，为CK1的功能研究和机制阐述提供了便利。在更广泛的范围内，有助于在拟南芥、水稻、小鼠和人类中识别新的候选底物。

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参考文献  
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2095927323005352#s0140 

文末看点｜lumingbio
上海鹿明生物科技有限公司是欧易生物旗下从事蛋白质组及代谢组质谱检测的专业质谱组学服务公司。公司建有空间代谢组商业服务平台，深耕质谱组学检测分析，具体包括空间代谢组、双平台代谢组、靶向代谢组、TMT标记定量蛋白组、翻译后修饰蛋白组、4D-DIA蛋白组、单细胞及超微量蛋白组、空间蛋白组等。创新质谱组学平台广泛应用于机制解析、分型诊断、标志物筛选、药靶发掘等多个领域。公司并先后获得高新技术企业、上海市专精特新企业并建有院士专家工作站，自有包括tims tof pro2在内的各类大型质谱近二十台套，年服务项目超2000项。鹿明生物协助合作伙伴发表SCI论文近千篇，成功打造以硬数据、好服务为基础，以空间代谢组为特色的质谱组学检测服务公司品牌。