前言

 

2022年1月，中央研究院化学研究所陈拥军团队在Nature Communications发表的题为“Streamlined single-cell proteomics by an integrated microfluidic chip and data-independent acquisition mass spectrometry”的研究成果，本研究将用于一体化蛋白质组学样品制备的微流控芯片和用于单细胞蛋白质组学分析的数据非依赖性采集（DIA）质谱相结合（chip-DIA），在20个哺乳动物细胞中平均分析约1500个蛋白质；并应用chip-DIA工作流程来分析贴壁和非贴壁恶性细胞的蛋白质组，实现了5个数量级的动态范围的检出，具有良好的重现性。Chip-DIA工作流程提供了一体化的细胞表征、分析灵敏度和准确性，并可在未来增加其他功能，从而为先进的单细胞蛋白质组学应用奠定了基础。

 

 

中文标题：通过集成微流控芯片和DIA质谱简化单细胞蛋白质组学研究

研究对象：人肺腺癌细胞系PC-9、人B-CLL细胞系MEC-1

发表期刊：Nature Communications

影响因子：14.919

发表时间：2022年1月10日

研究单位：中央研究院化学研究所

运用生物技术：单细胞蛋白组学

 

研究背景

 

基于单细胞组学的快速发展彻底改变了现代生物学研究，但由于蛋白质组成分的动态范围很宽，并且缺乏可行的蛋白质扩增策略，蛋白质组学分析的灵敏度受到限制。基于质谱（MS）的蛋白质组学方法具有高特异性、高覆盖率和无需标记等优点，在一些研究中已被证明可以达到单细胞灵敏度。在大多数传统的质谱工作流程中，很多步骤处理会导致样品的显著损失，因此微量样品的微蛋白质组学的工作流程被广泛开发，目前已经可以将基于MS的蛋白质组学分析扩展到有限的输入样品中（<1000个细胞）。然而，从多重细胞捕获和成像、细胞裂解和蛋白质酶切到肽脱盐的全自动工作流程尚未建立，因此，在本研究中，构建了具有不同细胞容量的芯片，以促进不同细胞输入的最佳分析深度的实验，同时展示了具有一体化功能的微流体设备，以实现自动化和简化的蛋白质组学制备，为有限的输入样品（包括单个细胞）提供高灵敏度和可重复性。

 

研究思路

 

研究结果

 

集成蛋白质组学芯片的设计和表征以及简化的微蛋白质组学工作流程

 

为了给质量有限的样品提供简化的微蛋白质组学流程，作者设计了一种微流体装置作为集成蛋白质组学芯片（iProChip，图1），以提供从细胞输入到完整的蛋白质组学样品处理的一体化功能。为了提高蛋白质组的覆盖率，采用了一种深度的单次分析策略，利用Orbitrap质谱仪整合了DIA分析。同时开发了一个由混合DDA-DIA数据集补充建立的光谱库资源，使用的是由不同蛋白质组组成的癌细胞系或免疫细胞系，它可以作为数字地图，理论上恢复DIA数据的m/z和保留时间域中的所有肽信息。

详细地说，就是对由不同细胞数的细胞系构建的光谱库进行了测试和优化，以大限度地增加识别和量化的蛋白质数量。与外部独立细胞分选仪相比，这个装置的内置模块可提供简单、快速和高效的细胞分离。作者还试图表征试剂是否可以在细胞裂解和蛋白质消化过程中在封闭的容器中有效混合，结果表明，涡旋、振荡和扩散混合这三种混合策略都足以适应反应动力学，且都符合进行蛋白质组学工作流程的时间尺度。

 

图1 | 集成蛋白质组学芯片示意图和微量蛋白质组学的简化工作流程

 

iProChip与DIA质谱的联用

 

为了在蛋白质组学工作流程中操作iProChip，作者使用内置细胞捕获器捕获精确数量的细胞，包括1、5、10、50和100个细胞。同时作者使用一种缓冲液实现了一锅细胞裂解、蛋白质还原和烷基化，以大程度地减少样品损失。在每次实验之前，作者强调需要将细胞室和反应容器涂有牛血清白蛋白（BSA），以尽量减少肽的吸附损失。对于随后的液相色谱（LC）–MS/MS分析，优化了单次DIA-MS采集参数，包括分离窗口、分辨率、肽量和LC–MS/MS梯度，以增强低数量细胞中的蛋白质组学谱分析覆盖率。

 

为了允许DIA对低丰度和癌症相关蛋白质进行深度分析，使用了肺癌和人类慢性淋巴细胞白血病细胞系构建了高质量的特异性光谱库。为了评估基于DIA的iProChip定量的性能，作者使用iProChip处理13–14个PC-9细胞，并与传统的DDA方法进行了比较，系统地分析了灵敏度、蛋白质组覆盖率和重现性的优势（图2）。

结果表明由直接DIA（dirDIA）和文库辅助DIA（libDIA）互补处理的单次基于DIA的LC-MS/MS提高了iProChip中全自动样品制备的小规模样品的蛋白质组鉴定覆盖率。为了评估iProChip-DIA工作流程的再现性，作者计算了14个PC-9细胞的一式三份分析之间重叠蛋白质的百分比。结果表明，iProChip-DIA方法具有更高的重现性和蛋白质组覆盖率。

 

图2 | 通过DIA和DDA方法比较PC-9细胞蛋白质组学分析的鉴定覆盖率和定量性能

 

通过iProChip和DIA-MS对质量有限的样品进行定量蛋白质组分析

 

接下来，作者系统地评估了iProChip-DIA在具有10，50和100个阱的腔室中对PC-9细胞进行蛋白质组学分析的性能情况，结果表明，iProChip-DIA在蛋白质组学分析中具有较高的灵敏度。为了将iProChip与散装样品处理进行比较，作者直接在小瓶中处理了约100个细胞，通过注入对应于1.5ng（10个细胞）和15个ng（100个细胞）的小等分试样进行DIA分析，与小瓶（50μg裂解物）中基于稀释的处理进行比较，发现从iProChip工作流程中获得的鉴定量在1.5 ng时增加了2倍。为了评估定量蛋白质组学方法的分析再现性，通过成对相关性分析对一式三份数据集中的蛋白质丰度进行了定量比较。结果显示，通过iProChip-DIA工作流程测量蛋白质丰度，具有良好的再现性（图 3）。

 

图3 | iProChip-DIA在蛋白质组学分析中灵敏度、重现性和定量的分析性能

 

iProChip-DIA在白血病细胞蛋白质组学分析中的应用

 

从方法论开发的角度来看，代表异质性癌症类型的白血病细胞是开发敏感蛋白质组学工具的理想模型，因此作者研究了iProChip-DIA在不同细胞数的MEC-1细胞上的应用。结果表明iProChip-DIA进行蛋白质鉴定实现了良好的覆盖率和重复性，iProChip-DIA平台的一般适用性在人类B-CLL细胞系MEC-1上得到了证明（图 4）。

 

图4 | iProChip-DIA在MEC-1细胞蛋白质组学分析中的应用

 

通过单细胞集成蛋白质组学芯片（SciProChip）和DIA质谱增强灵敏度

 

受到蛋白质组覆盖和iProChip定量的结果启发，作者接下来实现了iProChip专用于20个单细胞的复合物处理，称之为单细胞iProChip（SciProChip）的技术。这种SciProChip被设计成包括20个腔室，每个腔室包含一个单细胞捕获器，以方便精确和无人值守地捕获一个细胞进行蛋白质组学处理。通过对细胞诱捕器的最佳定位和较窄的腔室尺寸，该芯片显示单细胞捕获的细胞使用效率提高了约40%（图 5）。

与iProChip相比，SciProChip的总处理量从312 nL减少到78.5 nL，C18填料柱的长度从2.5厘米减少到1厘米，这都有助于减少样品损失。为了兼容小细胞的输入，LC-MS/MS的梯度时间被减少到90分钟。与iProChip相比，SciProChip显示了更高的细胞使用效率和显著提高的蛋白质组覆盖率，同时保持了单细胞蛋白质组分析的良好可重复性。

 

图5 | 用于20-plex单细胞蛋白质组学分析的单细胞集成蛋白质组学芯片（SciProChip）

 

研究结论

 

作者设计了两种不同容量的芯片，实现了细胞分离、计数、成像和蛋白质组学处理的一体自动化，用于深入的微蛋白质组学（iProChip）鉴定以及单细胞水平（SciProChip）的定量。基于尺寸的分选允许快速和可量化的细胞分离和成像，避免了使用外部细胞分选器的必要性，如荧光激活细胞分选。这样一个精简的策略规避了多步骤样品转移过程中样品损失的限制，并大限度地减少了传统工作流程中的表面吸收，从而提高了蛋白质组的敏感性和良好的可重复性。

 

常规的蛋白组学工作流程中，步骤繁琐，样品转移过程中样品损失很大。iProChip和SciProChip被设计成一个通用的、可扩展的和强大的设备，不仅能够很好地减少样品损失，还具有高灵敏度、高重现性等优点，现有的蛋白质组学方法可以很容易地集成到其中以适应不同的应用。

蛋白组学技术可以提供细胞状态和调控的功能信息，本研究建立了单细胞蛋白组学方法，实现了高灵敏度的蛋白组学检测。该技术有助于揭示疾病的发病机制，探讨预后和风险相关的不同肾脏疾病亚型中的蛋白组学异质性和独特的蛋白标志物，为药物靶点治疗提供希望。

大规模单细胞分析对于捕获复杂细胞系统中的生物异质性至关重要，但仅基于RNA技术的单细胞转录组学数据并不能很好地代表蛋白质水平上的变化。而单细胞蛋白组学技术能够从蛋白质水平上破译细胞机制并且获得更多的信息。

4月，鹿明生物将隆重地推出基于4D蛋白组平台的单细胞蛋白组技术服务。该技术可针对单细胞、微量单类群细胞、微量穿刺样本等珍稀样本进行分析，带来极微量样本检测更高更深更稳定更精确的结果。欢迎扫描下方二维码咨询鹿明生物单细胞蛋白组学技术工程师
 

 

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