如何利用非天然氨基酸开发高选择性去泛素化酶探针？

1. 如何开发高选择性去泛素化酶（DUB）化学探针？

去泛素化酶（DUBs）在细胞内负责移除蛋白质上的泛素修饰，在病毒感染、神经退行性疾病及癌症等多种病理过程中发挥关键作用，是极具潜力的治疗靶点。人类基因组编码约100种DUB，然而目前缺乏能够特异性识别并表征其活性的化学工具，限制了在生理与病理条件下对其功能的研究。尽管商品化的广谱荧光底物（如C端泛素序列或荧光标记泛素分子）已广泛应用于DUB的生化分析，但仍亟需开发能够针对单个DUB的高选择性探针。

2. 如何利用非天然氨基酸筛选DUB的底物偏好？

来自波兰弗罗茨瓦夫理工大学的Marcin Drag教授和Wioletta Rut教授团队在Chemical Science上发表了一项研究，致力于构建基于泛素（Ub）支架的高选择性DUB化学探针。该策略的核心是将非天然氨基酸引入保守的C端Ub序列，以系统筛选DUB的底物识别偏好。

研究以两种重要的癌症相关DUB——MERS PLpro和UCH-L3为模型，构建了两类化学底物文库：一类用于筛选P2位点偏好（Ac-Leu-Arg-P2-Gly-ACC），另一类为混合底物文库，用于评估P3和P4位点的特异性。筛选结果显示，MERS PLpro在P2位点偏好甘氨酸，而UCH-L3更倾向脂肪族氨基酸；在P3位点，UCH-L3强烈偏好精氨酸，MERS PLpro则更接受疏水性残基。基于这些特异性图谱，作者合成了相应底物，并经由动力学实验验证了其高选择性。

3. 能否构建具有选择性的泛素基不可逆探针？

在明确底物特异性的基础上，作者进一步设计了基于Ub的活性探针。这些探针在N端引入检测标签（如生物素），C端则嫁接不可逆亲电基团——乙烯基甲基酯（VME），该集团可广泛与DUB活性位点共价结合。

酶动力学分析表明，所构建的B-Ub-UCHL3-2-VME和B-Ub-MERS27-VME分别对UCH-L3和MERS PLpro表现出高效和特异性标记能力，其效果显著优于野生型Ub-ACC底物。后续在细胞裂解液中的实验进一步证实了这些探针具有良好的选择性和细胞活性。

4. 该策略是否为DUB研究提供通用化工具开发平台？

本研究通过将非天然氨基酸嵌入泛素分子框架，成功开发出一套活性与选择性兼具的DUB化学探针构建策略。该方法不仅适用于UCH-L3和MERS PLpro，更具潜力推广至其他DUB及泛素类似特异性蛋白酶的研究中，为探索DUB在疾病中的作用机制及开发靶向疗法提供了强有力的化学工具。

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